YWHAB介导肝脏胰高血糖素受体对糖代谢的作用及机制研究

Excessive glucagon secretion play an important role in the pathogenesis of diabetes. In liver glucagon could exerts its action through the G protein-coupled receptor （GCGR）via cAMP and PKA pathway regulating the balance of blood glucose in vivo. To date , a wide array of accessory proteins have been shown to interact directly with the G protein coupling receptors to form functional protein interactomes and regulated their downstream signaling, but it has not been reported whether there is any GCGR auxiliary binding proteins and the function of them . We developed affinity purification followed by mass spectrometry (AP-MS) to screen the GCGR auxiliary binding protein in the liver and found that YWHAB can interacts with the liver GCGR .we also validated that YWHAB can regulate glucagon-stimulated glucose metabolism , but its exactly molecular mechanisms are still unclear . Therefore, our work is aimed to (1) clarify the molecular mechanisms of YWHAB on regulating the glucagon-stimulated glucose metabolism and signaling pathways by establishing an overexpression/knockdown of YWHAB gene hepatocyte model (2)observe the function of YWHAB on glucose metabolism by using a mouse model of the liver specific YWHAB knockout or liver YWHAB gene suppression mouse model, and high-fat diet mouse model. All of that will provide a new ideas for the clinical application of YWHAB.

胰高血糖素分泌过多是糖尿病发病机制中的一个重要原因。在肝脏中胰高血糖素可以与其受体（GCGR）结合通过PKA-cAMP途径调控血糖。近几年研究发现新辅助蛋白可以与G蛋白偶联受体结合并调节其下游的信号通路，但是与GCGR受体相互作用的蛋白还尚未报道。我们前期通过亲和纯化-质谱法（AP-MS）筛选出GCGR的辅助结合蛋白之一YWHAB蛋白，发现其与肝脏GCGR结合后，可以改变胰高血糖素刺激下的糖代谢，但是对其相关确切的分子机制不清楚。因此此研究拟为：（1）建立沉默/过表达YWHAB基因肝细胞模型，研究YWHAB在胰高血糖素作用下对糖代谢的影响作用及其信号途径，阐明其在糖代谢中的作用及其作用机制。（2）采用肝脏特异性敲除YWHAB基因小鼠或肝脏YWHAB基因抑制小鼠模型，观察模型鼠整体的YWHAB对糖代谢的影响作用，以及高脂对待后的动物体内及肝脏的糖代谢作用，这些研究将为新药的开发提供新的思路。

近年来在对糖尿病的发病机制的研究中发现，胰高血糖素分泌过多也是重要原因之一。而胰高血糖素其主要作用是通过与其受体结合参与肝脏的糖代谢。通过干预胰高血糖素与受体的作用降低血糖治疗2型糖尿病理论上认为是可行的，也是目前的研究热点。胰高血糖素受体是一个具有7个跨膜序列的G蛋白偶联受体（GPCRs），主要分布于肝脏。我们运用Western blot的方法验证了胰高血糖素受体在小鼠的多种组织中都有表达。GPCRs具有七次跨膜结构域和通过激活异源三聚GTP结合蛋白（G蛋白）调节细胞内代谢的能力，是主要的药物靶标。GPCRs相关辅助蛋白对受体的转运、表达以及信号转导具有重要作用。GCGR作为GPCRs的一种，寻找其相关辅助蛋白以调节GCGR信号通路具有理论可行性。本课题组前期通过与加拿大多伦多大学医学生理系Wheeler教授合作，应用质谱法（AP-MS）以及亲和纯化的方法成功筛选出33种GCGR结合蛋白，其中之一为YWHAB。YWHAB蛋白又称酪氨酸3-加单氧酶/色氨酸5-加单氧酶激活蛋白，是一种胞浆蛋白，在多种组织均有表达，哺乳动物中存在7个亚型（β、γ、ε、ζ、η、σ、τ）。YWHAB可与蛋白相互作用，参与细胞凋亡、代谢、基因表达的转录调控等众多重要生命活动的调节过程。我们的实验首次发现YWHAB蛋白与胰高血糖素受体结合，并通过YWHAB和GCGR共转染结合免疫共沉淀，证明了YWHAB蛋白和GCGR蛋白的结合。此外，本研究通过人肝癌细胞系HepG2、小鼠原代肝细胞和小鼠基因敲除及过表达模型，明确肝脏YWHAB过表达减少丙酮酸刺激的葡萄糖生成，并阐明YWHAB通过结合GCGR，抑制cAMP/PKA通路，减少FOXO1表达同时抑制FOXO1核定位，从而抑制糖异生关键酶PEPCK和G6Pase的表达进而减少糖异生。本研究为寻找新的治疗糖尿病药物提供了线索，同时也为更进一步阐明糖尿病的发病机制提供新的理论。