Cldn7和SOX9相互作用调控β-catenin信号通路维持大肠癌干样细胞特性的分子机制研究

As a potential tumor suppressor gene, tight junction protein Cldn7 may play an important role in the tumorigenesis, invasion and metastasis of colorectal cancer by regulating epithelial mesenchymal transition (EMT). However, the mechanism of Cldn7 is still unclear. The applicant has constructed Cldn7 systemic knockout mice which showed extensive intestinal inflammation, hyperplasia and intestinal stem cell molecular SOX9 abnormalities. Based on the previous work, we put forward the following assumptions: The interaction between Cldn7 and SOX9 participate in the regulation of the activity of colorectal cancer stem like cells, and maintain the malignant biological behavior of colorectal cancer stem cells by regulating the expression of β-catenin/EMT. In this study, we constructed an inducible intestinal conditional Cldn7 knockout mice model, combined with cells and nude mice experiment, molecular biology and bioinformatics methods to analyze the relationship between Cldn7 related signal pathway and intestinal stem cells in the spontaneous intestinal tumor of various types of knockout mice in the whole, the organization and the molecular level. It is useful for us to reveal the effects of Cldn7 on intestinal stem cell characteristics and the molecular mechanism of inducing the occurrence and development of colorectal cancer. The implementation of this project is expected to provide a new platform for the study of the role of Cldn7 in the development and progression of intestinal tumors.

紧密连接蛋白Cldn7被认为是潜在的抑癌基因，可能通过调控上皮细胞间质化(EMT)参与肿瘤的发生、侵袭和转移，但这一机制尚不明确。申请人曾构建Cldn7全基因敲除小鼠模型并出现肠道的广泛炎症、增生和肠道干细胞分子标志物SOX9表达异常。我们在前期工作基础上，提出如下假设：Cldn7和SOX9相互作用参与大肠癌干样细胞的活性调控，并通过调节β-catenin/EMT的发生维持了大肠癌干样细胞的恶性生物学行为。本研究拟通过构建一组可诱导肠道条件性Cldn7基因敲除小鼠模型，结合细胞、裸鼠实验，分别从整体、组织、分子水平结合分子生物学、生物信息学方法分析各类型基因敲除小鼠自发肠道肿瘤中Cldn7相关信号通路及与肠道干细胞之间关系，揭示Cldn7如何影响肠道干细胞特性及诱发结直肠癌发生、发展的分子机制。课题的实施将为研究Cldn7作为治疗靶点及在肠道肿瘤发生中的作用机制提供研究平台。

结直肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率与死亡率明显上升，已严重威胁人类生命健康。本研究重点利用一组可诱导肠道条件性Cldn7基因敲除小鼠，结合细胞、裸鼠种植实验以及临床组织标本，阐明Claudin-7缺失以及与SOX9相互作用介导β-catenin/EMT的发生机制，为解析干细胞向肿瘤干细胞转化的分子机制奠定基础，并为大肠癌的治疗提供新的干预靶点。经过五年的研究工作，课题组初步获得了四个方面的研究成果: 一、成功构建了Claudin-7稳定低表达的大肠癌干细胞系，并利用该细胞系进行了细胞实验以及裸鼠成瘤实验，实验结果证明Claudin-7表达降低促进了大肠癌干细胞的增殖、迁移能力，抑制了凋亡能力，且裸鼠成瘤实验证实了Claudin-7低表达的大肠癌干细胞具有更强的促进肿瘤形成的能力。二、课题组对Claudin-7敲除前后的大肠癌干细胞进行差异蛋白检测，发现Claudin-7表达减少后，干细胞分子标志物SOX9、OLFM4，βcatenin及通路下游靶基因C-myc、CyclinD1，增殖相关蛋白Ki67表达明显增加。提示Claudin-7的表达降低可能通过激活Wnt/β-catenin通路引起了干性增强。与此同时，Claudin-7可诱导性肠道条件性基因敲除小鼠的构建和表型分析，在小鼠体内验证了这一结果。三、课题组收集了多例大肠癌组织、转移组织以及癌旁组织标本并结合大肠癌细胞系以及Claudin-7可诱导性肠道条件性基因敲除小鼠，利用免疫组化、Westernblot等技术进行Claudin-7和Sox9表达的检测，结果提示Claudin-7和Sox9之间可能存在负调控机制。Co-IP实验结果显示在蛋白水平Claudin-7和Sox9在蛋白水平存在相互作用，但这种作用是间接的，提示Claudin-7表达下调激活Wnt/β-catenin通路可能是通过与SRY相关促HMG盒基因家族的Sox9在蛋白层面相互作用实现的。四、基于可诱导的肠道条件性Claudin-7基因敲除小鼠，从体内水平验证了Claudin-7敲降加剧肠道破坏、促进腺瘤以及肿瘤的形成，基因敲除的实验组小鼠肠道中高级别分化肿瘤所占比例以及肿瘤组织和癌旁组织的上皮增值率高于对照组。并且初步验证Claudin-7与SOX9相互作用调控β-catenin/EMT在大肠癌发生和侵袭中的作用。