KLF7调控鸡脂肪组织发育靶基因的鉴定与功能分析

KLF7 plays roles in preadipocyte differentiation in vitro. However, in vivo its roles and regulatory mechanisms are still unknown. In view of this, base on the screening of KLF7 target genes in chicken using chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq), this project tends to identify and perform the functional analysis on these target genes. The first aim is to identify the target genes using ChIP-qPCR assays, luciferase reporter assays and so on. The second aim is to confirm the exact binding sites of KLF7 using electrophoretic mobility shift assays and site-directed mutagenesis reporter gene assays. The last aim is to select two or three new target genes to research their functions in adipocytes proliferation and differentiation. This project will systematically identify of KLF7 target genes in chicken adipose tissue, and clarify the roles and regulatory mechanisms of KLF7 in chicken adipose tissue development. The results from this project will contribute to understanding the molecular mechanisms underlying adipose tissue development and provide the theoretical basis for improving broiler breeding program.

转录因子KLF7调控体外脂肪细胞分化，但其在体内的功能及调控机制尚不清楚。鉴于此，本研究拟针对前期鸡KLF7的染色质免疫共沉淀-测序（ChIP-seq）筛选的靶基因，进行系统地鉴定与功能分析。采用ChIP-qPCR及启动子荧光素酶报告基因等技术鉴定靶基因；采用凝胶阻滞及报告基因定点突变技术确定KLF7的精确结合位点。最后，选择2-3个靶基因开展其在鸡前脂肪细胞增殖和分化中的功能分析。本研究将系统地鉴定出KLF7在鸡脂肪组织中的靶基因，揭示KLF7在鸡脂肪组织发育中的作用及调控机制。研究结果有助于认识脂肪组织发育的分子机制，并将为培育低脂家禽的遗传育种工作提供新的思路和理论依据。

体外实验证实，哺乳动物和禽类KLF7促进前脂肪细胞增殖，抑制分化，但其作用机制并不清楚，目前也尚未鉴定出KLF7在前脂肪细胞中的靶基因。为此，本项目对KLF7的靶基因进行了系统地鉴定和功能分析，探讨其在鸡脂肪组织发育中的作用及分子机制。研究首先构建了KLF7慢病毒表达载体，包装病毒感染鸡前脂肪细胞系，筛选并获得了稳定过表达KLF7的细胞株。然后以该细胞株为材料，进行ChIP-seq分析，结果共获得11063个Peaks，其中位于近端启动子区的Peak相关基因1925个。Peak相关基因参与TGF-β信号通路、脂肪酸代谢通路、Notch信号通路等与脂肪发育有关的信号通路过程，在脂质代谢、质膜的组成等方面发挥作用。Motif分析发现，鸡KLF7的主要DNA结合基序为5´-TGCGCCGRGC-3´和5´-CCGKCGAC-3´。进一步挑选Peak相关基因进行鉴定，发现过表达KLF7显著促进TNNI2、GATA3、CDKN3和PTX3的表达，抑制HIF1A的表达，说明KLF7能够靶作用于这些基因。荧光素酶报告基因结果显示，过表达KLF7能够影响CDKN3、TNNI2的转录活性；结合位点缺失突变荧光素酶报告基因分析发现，KLF7能够分别结合在HIF1A和GATA3的5’侧翼区特定位点，进而调控其转录活性。靶基因的功能分析表明，GATA3基因能够抑制鸡前脂肪细胞分化，GATA3可能介导KLF7在前脂肪细胞分化中的作用。另外，基因表达模式提示，TNNI2和HIF1A两个基因可能对鸡脂肪组织发育起促进作用。综上所述，本项目对KLF7在鸡前脂肪细胞中的靶基因进行了系统地筛选、鉴定和功能分析，研究结果对于揭示鸡脂肪组织发育机制和脂肪过度沉积机理提供了重要的理论依据。