线粒体DNA介导cGAS-STING-TBK1-IRF3信号通路在抗HBV固有免疫中的作用研究

Type I interferon (IFN) plays an important role in innate immunity of anti Hepatitis B virus (HBV). Therefore, study to explore the mechanism of IFN-α production in pDCs is favorable for the host to clear HBV. In the previous study, we have found that mitochondrial DNA (mtDNA) copies were associated with concentration of HBV marker in peripheral blood mononuclear cells of untreated chronic hepatitis B patients, and the expression of cGAS and STING was increased. However, whether mtDNA could activate cGAS-STING-TBK1-IRF3 signaling pathway in pDCs, and promote the expression of type I interferon is still unknown. In order to clarify this problem, this project intends to collect HBV patient pDCs isolated by magnetic beads sorting and build the mtDNA damaged pDCs model, further to overexpress and interfere the expression of pDCs and STING genes, and to observe the changes of mtDNA morphology and quantity and IFN-α expression in pDCs. On the basis of this, we finally discuss the value of mtDNA-mediated cGAS-STING-TBK1-IRF3 signaling pathway in anti-HBV innate immunity. The finding of the study is expected to deepen the mechanism of type I interferon in pDCs, which provide new ideas and targets for the treatment of HBV.

I 型干扰素在抗HBV固有免疫中具有重要作用，因此研究pDC中IFN-α的产生机制，有利于宿主清除HBV。在前期研究，我们在未治疗的慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞中发现：线粒体DNA(mtDNA)拷贝数与HBV血清标志物浓度密切相关；cGAS和STING蛋白表达量增高。那么HBV感染时，pDC中mtDNA能否激活cGAS-STING-TBK1-IRF3信号通路，促进I型干扰素表达？为明确这科学问题，本课题拟通过磁珠分选HBV患者pDC和构建mtDNA损伤的pDC细胞模型，对cGAS和STING基因进行过表达和干扰调控，观察pDC中mtDNA形态及数量和IFN-α的表达水平的变化情况，在此基础上进一步讨论mtDNA介导cGAS-STING-TBK1-IRF3信号通路在抗HBV固有免疫中的价值。本课题研究有利于认识pDC中I 型干扰素的产生机制，进一步为治疗HBV研究提供新的思路和靶点。

CHB的发病机制较为复杂，慢性HBV持续感染与宿主不能形成有效的抗病毒反应有关，但具体机制未明。固有免疫应答在HBV感染初期发挥作用，并诱导后续的特异性免疫应答。HBsAg在血清中浓度可高达到100 mg/mL，因而HBsAg也可严重影响外周血免疫细胞如单核/巨噬细胞的功能，从而抑制免疫细胞固有免疫应答功能，促进免疫逃逸。cGAS-STING信号通路在宿主抗HBV中发挥重要作用，cGAS-STING功能的缺失可导致HBV的持续感染。cGAS在外周血免疫细胞中，主要表达在单核/巨噬细胞系统，因此探讨HBsAg能否调控单核/巨噬细胞cGAS-STING信号通路介导的固有免疫应答，对于了解CHB的发病机制具有重要的意义。本研究发现，在CHB患者外周血单个核细胞中，cGAS mRNA水平较正常人升高；cGAS和IFN-β mRNA水平在HBsAg高浓度组（HBsAg≥250 IU/mL）中明显降低。此外cGAS mRNA水平与HBsAg血清浓度呈负相关。WB结果进一步证实： HBsAg高浓度组中cGAS蛋白水平明显降低。. 收集健康人PBMC，加入rHBsAg 25 μg/mL刺激培养24 h，WB结果发现cGAS蛋白表达水平降低。THP-1细胞经50 nM的PMA处理24 h分化为巨噬细胞后，加入40 μg/mL的rHBsAg处理24 h，WB结果发现： rHBsAg可显著抑制cGAS蛋白表达，IRF3的磷酸水平和IFN-β mRNA的水平。Transwell表明；rHBsAg可通过抑制cGAS-STING信号通路，从而促进HepG2.2.15细胞中HBV DNA复制。. 在THP-1巨噬细胞中加入rHBsAg 40 μg/mL刺激培养24 h后发现，cGAS的转录因子CREB蛋白水平和磷酸化水平均降低但转录因子SP1无明显改变。进一步使用10 nM Bafilomycin A1抑制溶酶体酸化从而阻止THP-1巨噬细胞对rHBsAg的内吞，WB结果表明CREB的蛋白及其磷酸化水平和cGAS蛋白水平均可得到部分回复。. 基于前期研究及我们的预实验结果，我们认为HBsAg可通过抑制单核/巨噬细胞CREB蛋白的表达水平及其磷酸化水平，从而抑制cGAS蛋白的表达，进一步抑制cGAS-STING信号通路产生IFN-β，最终可促进CHB的发生发展。