抗生素压力对嗜麦芽窄食单胞菌致病性的影响

以前期发现的同一患者、不同时期呼吸道分离的嗜麦芽窄食单胞菌临床株为对象，用RT-qPCR了解其耐药基因表达差异，用常规微生物学方法检测细菌的常见毒力因子（内毒素、蛋白水解酶、磷脂酶、弹力酶、凝血素），筛选毒力差异的配对菌株。采用抑制消减杂交技术（SSH）比较配对菌株的差异片段，用常见耐药基因和毒力基因探针作分子杂交，初步分析差异基因的类别。同时运用蛋白组学技术，分析配对菌株的差异蛋白，质谱分析推测蛋白功能，结合SSH试验结果，明确与毒力因子变化有关的功能基因结构。以存在与毒力变化有关的差异蛋白的配对株为对象，在体外抗生素环境中培养传代，以RT-qPCR分析抗生素处理前、后差异基因mRNA水平变化，并明确何种抗生素对差异基因的表达水平影响明显。从而初步明确在抗生素压力环境中，嗜麦芽窄食单胞菌的进化特征，为彻底揭示嗜麦芽窄食单胞菌的致病性，研究新型抗菌药和预防疫苗提供理论依据。

嗜麦芽窄食单胞菌是院内感染常见病原菌，传统认为该菌是长期使用广谱抗菌药物所选择出。已有的临床研究发现，嗜麦芽窄食单胞菌可长期定植于患者呼吸道，导致慢性感染，即使使用针对性抗菌药物治疗，也难清除，其相关机制尚不清楚。本研究旨在了解嗜麦芽窄食单胞菌在抗生素压力下，在其耐药机制发生变化时，相关毒力因子的表达变化，重点从基因组学探讨生物膜相关的致病性的变化规律。分析显示，抗生素选择压力、主动外排泵SmeDEF过渡表达和生物被膜形成存在一定的关联性。运用微生物、分子生物学、扫描电镜和激光共聚焦技术，首先研究嗜麦芽窄食单胞菌在环丙沙星诱导下，主动外排SmeDEF表达量上调，可能导致菌株对环丙沙星的MIC有4倍上升，但毒力相关因子，如I型菌毛、胞外蛋白水解酶、弹力酶、磷脂酶的编码基因表达水平并未改变。但以此为基础，构建生物膜体外模型时发现，存在相应耐药机制的细菌与对照比较，细菌形成生物被膜的形态结构和参与生物膜形成的相关基因存在差异。SmeDEF高表达株更易形成厚而成熟的生物膜，而参与生物膜形成的相关基因spgM、rmlA的多位点氨基酸变异与SmeDEF高表达有关。但在抗生素压力与生物膜关系时发现，以工程菌ATCC ATCC13637构建生物膜模型时，红霉素、头孢他啶、亚胺培南都对生物膜形成无影响，1/4和1/2 MIC浓度的环丙沙星可破坏处于形成早期的生物膜（孵育8h内），但不能破环成熟期的生物膜（孵育24后），1/4和1/2 MIC浓度的左氧氟沙星、莫西沙星对于早期和成熟期的生物膜都能破环。但检测了spgM、rpfF 、rmlA基因的变异和表达，结果除了前述的氨基酸突变点外，spgM和rmlA基因未出现新的突变点，rpfF未出现变异；而RT-qPCR检测这几个基因的结果提示，仅环丙沙星作用后，rpfF基因表达上升1.6倍，而头孢他啶、亚胺培南都未导致spgM、rpfF 、rmlA基因的变异和表达变化。因此，推测抗生素压力不仅调动了SmeDEF高表达，同时可能还影响其它功能基因的表达变化，而从一个未完成嗜麦芽窄食单胞菌强毒力临床株的基因组测序结果发现，在临床环境中，嗜麦芽窄食单胞菌发生大的基因突变，甚至成为一个新物种已成为可能，后续研究将以此为基点，继续深入研究。