炔基修饰的核酸探针更选择性地靶向被叠氮化学标签特异标记的癌细胞

Telomerase exclusively extends the chain growth of telomeric DNA. Over-activated specifically in most human cancers, telomerase incorporates and thus selectively enriches its natural substrate analogue AZT at 3′-end of telomeric DNA in cancer cells. Accordingly we propose that the azido group of incorporated AZT functions as a chemical tag to specifically label cancer cells. Through known azide-alkyne cycloaddition of click chemistry reaction, the alkynyl modified probe can subsequently identify cancer cells labeled with the azido tag. Nevertheless, due to possible side effect, AZT might be mistakenly recognized by DNA polymerase of normal cells. As a result, it would lead to the incorporation of AZT into normal cells, however at any internal random positions of chromosome. To fix this false labeling issue, we design an alkynyl-modified nucleic acid probe which recognizes azido tag of cancer cells more specifically and readily. It can be achieved by the arrangement of the alkynyl and azido groups in proximity via the formation of an intermolecular G-quadruplex between the proposed oligonucleotide of alkynyl probe and the guanine-rich single-stranded telomeric DNA. Furthermore, to fulfill dissimilar preferences of sugar pucker conformations adopted by the substrate analogues bound to telomerase of cancer cell and DNA polymerase of normal cell respectively, the fluorine-modified AZT analogues which display different sugar conformations are projected in order to further improve the specificity of cancer-specific tagging. The consequence of chemical tagging can be directly quantified by 19F NMR technique. Combined with both specific tagging and selective probing approaches, it eventually achieves the detection of cancer cells with high specificity through above double targeting strategies. This project broadens the scope of research thoughts in the field of cancer treatment and detection.

端粒酶专一催化端粒DNA延长，且在绝大多数癌细胞中才表现出特异性过度活化。本课题因而提出：底物类似物AZT被端粒酶选择性掺入富集到癌细胞的端粒DNA末端，而AZT本身的叠氮基团由此成为特异标记癌细胞的化学标签；通过叠氮-炔烃点击偶联反应，此标签被后续炔烃探针识别。当AZT也被正常细胞的DNA聚合酶催化时会引起误标记干扰，但AZT只掺入到染色体中间随机位置。我们利用AZT分别掺入癌、体细胞染色体的位置差异，结合端粒DNA富含鸟嘌呤G的特性，设计炔烃核酸探针与端粒DNA单链形成分子间G-四链体结构，借此提高炔烃探针只识别位于癌细胞端粒末端上叠氮标签的选择性。另外还利用端粒酶、DNA聚合酶分别对底物的糖环构象和柔性存有偏好差异，尝试具有不同特定糖环构象的氟取代AZT衍生物，以改善只针对癌细胞标记上化学标签的特异度，其效果由19F-NMR直接检测。通过标记加探针双重靶向策略，实现高特异检识癌细胞。

本项目围绕染色体端粒区与肿瘤密切关联的关键科学和技术问题，首先设想利用端粒酶只在癌细胞中才被特异性过度活化的天然特性，将其天然底物的类似物AZT选择性催化富集到癌细胞的端粒DNA的3’末端，使得AZT自身的叠氮基团通过后续叠氮-炔烃点击偶联反应，成为特异标记癌细胞的化学标签。我们相关的细胞实验验证了项目立项设想的正确。..考虑到AZT也会在一定程度上被正常细胞的DNA聚合酶识别催化，将掺入到染色体中间的随机位置，则要引起误标记干扰。本项目进一步设想利用AZT分别掺入癌、体细胞后，其所位于染色体的位置具有差异，再借鉴端粒DNA富含鸟嘌呤G碱基的特性，设计炔烃核酸探针与端粒DNA单链形成分子间G-四链体结构，借此提高该炔烃探针只会识别位于癌细胞端粒末端上叠氮标签的特异程度。我们体外NMR实验结果证明设想可行，通过形成了明确的G-四链体结构，短链探针能高效识别结合端粒DNA；同时细胞内的实验结果也进一步表明短链探针结合在DNA端粒区域。实现了本项目预期的主要研究目标，目前已经完成实验数据收集，论文的整理发表工作已在进行当中。..尽管检测的特异性有所改善，但细胞实验也显示其标记效率对于高灵敏地检测肿瘤细胞尚未达到完全理想的预期，仍有改进的空间。我们分析认为由于端粒G-链的3’最末端并不总是以固定单一的碱基结尾，而这种3’末端最后一个碱基组分的不均一性，被我们观测到的确造成了G-四链体结构的显著变化，进而会影响短链探针的结合。特别是发现了其中一个端粒DNA片段自身能够首先折叠成动力学优势的G-四链体结构，并在不改变糖磷骨架全局折叠构象的前提下，只通过改变局部G-四分体的氢键形成方式，最终转换成热力学稳定的结构。目前我们已经分别NMR解析了动力学有利与热力学稳定的三维结构，已开始论文的整理发表工作。..本项目在核酸探针设计与制备、端粒酶功能机理探索等方面取得了创新性研究成果，为新型探针的研究和发展提供了新的思路和技术支撑，为最终达到更加特异性检测、治疗癌细胞打下基础。