RANKL单克隆抗体Denosumab抑制人工关节假体周围骨溶解的研究

因无菌性松动而面临翻修的老年病人随着人工关节置换术的大范围应用而逐年增多。防止无菌性松动的方法除了改进关节假体的设计和材料、提高手术技巧外，主要是药物控制假体周围骨溶解。现已证明RANKL（NF-κB受体活化因子配体）/RANK/Osteoprotegerin系统是破骨细胞分化成熟并保持活性的关键因素，本研究旨在1、建立微粒激活的人骨髓间充质干细胞与破骨细胞的联合培养体系，体外观察Denosumab对破骨细胞分化和活性的移植效；应2、构建新型的人体组织SCID（严重联合免疫缺陷）小鼠移植模型，将RANKL的单克隆抗体Denosumab应用于人的假体 周围界膜组织，观察并分析其抑制骨溶解的生物学效应及细胞分子学机制；3、观察单次剂量的Denosumab抑制骨溶解的持续效应。以期评价Denosumab在抑制人工关节假体周围骨溶解过程中的应用价值。

目的： 通过对MC3T3-E1 成骨细胞内的信号分子进行抑制，筛选出影响MC3T3-E1 细胞增殖活性的信号通路，并对其有效性进行验证。.方法：选用44 种蛋白抑制剂分别作用于MC3T3-E1 细胞，通过MTS 法检测细胞活性，筛选出影响MC3T3-E1 细胞增殖活性的信号分子，并从中选择两种信号分子，用相应的抑制剂处理细胞，检测其有效性。通过向MC3T3-E1 细胞内加入抑制剂后，用FACS 法检测其对细胞周期的影响，再进一步通过Westernblot 检测相关蛋白在抑制剂处理后的细胞内的表达水平。.结果：44 种抑制剂处理MC3T3-E1 细胞后，通过MTS 法检测发现7 种抑制剂能明显抑制MC3T3-E1 细胞的增殖活性，分别抑制IGF-1R/INSR/ALK、AKT、SRC/ABL、KIT、PI3K、MET/VEGFR、mTOR 等信号分子。首先选取AKT 信号分子进一步研究，向MC3T3-E1 细胞中加入AKT 抑制剂PF-04691502，通过FACS法检测MC3T3-E1 细胞的周期，与对照组相比，处于G1 期的细胞比例明显增加，S 期和G2/M 期的细胞比例降低,说明细胞发生了周期阻滞，细胞增殖活性降低。接着，通过Western blot 检测，我们发现抑制剂处理后的MC3T3-E1 细胞内磷酸化的Akt、CCND1 表达降低，进一步说明细胞周期受到抑制，并且这种抑制作用与Akt 磷酸化水平降低有关。其次选取Dasatinib（靶点为SRC /ABL）、XL880(GSK1363089)（靶点为MET/VEGFR）两种抑制剂，分别作用于小鼠MC3T3-E1细胞，分析抑制剂对成骨细胞增殖周期的影响。与对照组比较，Dasatinib组Sub-G1细胞比例显著增高；XL880组Sub-G1期细胞比例显著升高，且两组药物间无显著差异。与对照组比较，Dasatinib可以抑制CCND1的表达，且可降低P-AKT的水平，对于P53及BAX的表达无明显影响。XL880可以抑制CCND1的表达，而对P-AKT、P53及BAX表达无明显影响。.结论：有多条信号通路影响成骨细胞的增殖，我们的研究为关节假体松动病人的治疗提供了潜在靶点的重要线索。