栽培小麦Brock白粉菌早期应答相关基因的筛选与功能研究

小麦白粉病是由白粉菌引起的真菌性病害。栽培小麦Brock强抗白粉病，但由于对Brock的抗病机理缺乏系统研究，Brock用于育种工作进展缓慢。本项目组多年来对Brock抗白粉病的遗传特性进行了系统的研究，认为Brock中含有一个新抗白粉病基因，且该基因呈显性单基因遗传，利用SSR方法将该新基因定位在染色体3BL上。本项目将以Brock材料，用涂抹法接菌，收获接菌10min到48h各时段叶片，提取mRNA，用于抑制消减杂交文库构建，筛选白粉菌诱导早期应答基因，分析这些基因的种类和数量；同时对前期工作已筛选到的受白粉菌诱导表达上调的Rpg5基因片段进行全长基因的克隆，用病毒介导的基因沉默方法验证克隆基因的功能，为阐明Brock的抗白粉病分子机理及生产上合理使用这一新遗传资源提供依据。

1.配制抗白粉病近等基因系Brock京4117.　　栽培小麦Brock，强抗白粉病，为父本；农艺性状优良但感病品种京411为 轮回亲本杂交，获得F1，F1与京411回交，每代均接种白粉菌15号生理小种。选抗病后代与京411回交，连续回交7代，再自交1代，育成近等基因系Brock/京4117（NIL）。 .2.不同抗、感特性的小麦与白粉菌互作的细胞学分析.　　以Brock、京411和NIL为材料，用15号生理小种感染叶片。白粉菌分生孢子在京411叶片萌发时间8h，24h形成附着胞，48h形成吸器，观察到二、三级吸器；而NIL、Brock叶片上菌萌发时间要晚，分生孢子出现畸形，叶片出现细胞质凝聚、晕环、乳突等结构。在NIL中，大量分瓣型附着胞在24h时出现，36h时出现纤细型附着胞，48h寄主细胞出现细胞质凝聚。初步证明供体亲本中抗病基因已渗入到近等基因系中。.3.构建栽培小麦Brock白粉菌诱导早期应答基因SSH文库.　　以接种白粉菌的Brock叶片cDNA为tester，不接菌Brock叶片cDNA为driver，利用SSH技术，构建Brock白粉菌诱导早期应答基因消减杂交文库。获2105个克隆。随机挑选100个阳性克隆，获76条非重复序列。经与GenBank同源比对, 发现其中56条与已知序列同源性较高。涉及抗病防御、能量代谢、转录因子、信号转导蛋白基因，初步认为小麦对白粉菌的抵抗为多个基因互作的结果。.4. 构建Brock白粉菌诱导下全长cDNA文库.　　由于SMART法构库用的Sfi I酶在1.25%的小麦基因中均有酶切位点，造成文库中全长基因比例下降，我们用Bsa I替换Sfi I构建小麦全长cDNA文库，库容为2.7×104个独立克隆。结合三中的ESTs对文库进行筛选，获得全长基因4个：Ta-X、Ta-Y、Ta-Z和Ta-STPK。.5. Ta-X、Ta-Y、Ta-Z和Ta-STPK功能分析.　　通过VIGS技术敲减抗病小麦中Ta-X、Ta-Y、Ta-Z和Ta-STPK，发现小麦的抗病性均发生改变，但这种改变与抗白粉病的关系将有待于进一步深入研究。.　　6. 抗病小麦近等基因系白粉菌诱导下线粒体蛋白质组学研究, 获得9个表达下调蛋白的归属,初步研究发现白粉菌胁迫下线粒体蛋白质组的动态改变与抗病性相关。