壳寡糖水凝胶对干奶期奶牛乳腺免疫功能的调节作用及分子机制

Mastitis is one of the most important diseases that constrain the healthy development of the dairy cow industry, which causing huge economic losses to dairy breeding. At the same time, the use of antibiotics poses a threat to human health. Dry-off period play an important role in preventing and controlling mastitis in dairy cows. During this period, the decline of breast's self-resistance is the direct cause of mastitis, however, there is still lack of effective preventive drugs and methods. In recent years, Chitooligosaccharide (COS), a degradation product of chitosan, has become a focus of research in the fields of medicine, food science and animal nutrition and immunology because of its biological activities such as immune stimulation and inflammation regulation. This project starts with the key issue of improving the mammary gland defense ability in drying-off dairy cows. Based on the injection of COS hydrogel into the mammary gland, this study investigates the immunomodulatory function of COS in mammary glands, accompanying with the MAPK and NF-κB signaling pathway as starting point, combined with iTRAQ technology and bioinformatics methods, the molecular mechanism of COS hydrogels' immunoregulation on mammary glands in dry dairy cows was explored, and this may lay a foundation for the further research and application of COS in cows’ immunity.

奶牛乳房炎是制约奶牛业健康发展的重要疾病之一，给奶牛养殖造成了巨大经济损失，与此同时，抗生素的使用也会对人类的健康造成威胁。干奶期是预防和控制奶牛乳房炎的重要时期，在这期间奶牛乳腺自身抵抗力下降是导致乳腺炎发生的直接原因，但目前仍然缺乏有效的预防药物和方法。近年来，壳聚糖的降解产物壳寡糖（Chitooligosaccharide，COS）以其具有免疫刺激和炎症调节等多种生物学活性，逐渐成为医学、食品科学和动物营养与免疫学等领域研究的焦点。本课题以提高干奶期奶牛乳腺防御能力这一关键问题出发，在奶牛乳房内注入COS水凝胶的基础上，研究COS对奶牛乳腺免疫功能的调节作用，同时以MAPK和NF-κB信号通路为切入点，结合iTRAQ技术和生物信息学方法，探究COS水凝胶对干奶期奶牛乳腺免疫调控的分子机制，为COS在调节奶牛免疫等方面的进一步研究和应用奠定基础。

本项目立足于奶牛养殖行业的市场需求，对当前制约奶牛业健康发展的奶牛乳房炎进行防治产品的开发与应用，率先采用纳米技术将天然无毒的海洋生物材料壳聚糖做为基质，制备出了一系列具有缓释功能和原位相变特性的复合温敏型水凝胶。首先，制备中分子量壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏水凝胶（MCS/β-GP Hydrogel）的最佳制备处方为：以0.1 mol/L稀盐酸溶液配制2% MCS溶液后，与β-GP溶液按7：3混合，其胶凝时间为4′12″ ± 19.6″，pH值为7.09 ± 0.14。冷冻电镜显示纳米复合水凝胶呈相互交联的网状结构。傅里叶红外变换光谱结果显示，MCS和β-GP之间形成氢键和络合物。XRD结果表明BLfcin-NPs对水凝胶的结晶性能影响不大。通过流变学试验发现，其相变点为24℃。细胞毒性试验和体外抑菌试验表明水凝胶具有良好的生物相容性和体外抗菌活性。其次，通过大鼠乳腺炎模型蛋白质组学结果表明，共鉴定出 5929 个蛋白质，与对照组相比，乳腺炎模型组共有 555 个差异表达蛋白，其中428个蛋白上调和127 个蛋白下调。GO 和 KEGG 富集分析结果表明，上调的差异显著表达蛋白(DSEPs)主要与免疫反应相关，包括整合素α M、α-胰蛋白酶抑制剂重链4和α- 2巨球蛋白。另外，通过对干奶期奶牛乳腺内注射凝胶研究发现，可显著降低血清中IL-8、SAA和IL-6的含量。微生物组成分析结果表明，乳汁中多样性指数显著低于注射前（P<0.05）。Proteobacteria, Firmicutes和Actinobacteria 是 3 个主要的门水平菌群。非靶向代谢组学结果表明，在注射前后共发现74个代谢物质存在显著性差异。KEGG富集分析结果表明，差异代谢物主要富集在鞘脂代谢、鞘脂信号通路、甘油磷脂代谢和ABC转运蛋白等。此水凝胶能改善奶牛乳腺对微生物感染的防御能力，并增强奶牛乳腺自身抗病和恢复能力，通过维护奶牛机体健康提高奶牛生产性能。该系列产品可部分替代或减少奶牛生产中抗生素的使用，在解决抗生素耐药、残留问题，提高乳产品安全和品质方面具有明显优势。本产品的推出对于加快推进绿色健康养殖，保障我国人民的乳品安全具有重要意义，可产生较大的经济、社会和生态效益，具有广阔的市场前景。