谷氨酸提高耐药菌对抗生素敏感性的分子机制研究

With the misuse of antibiotics, the issue of antibiotic resistance in bacteria is becoming increasing severe in China. It not only causes trouble for clinical treatment, but also brings great threatenings to the public health. The previous research of applicant demonstrated that alanine, glucose, and fructose promote the antibiotic uptake by drug-resistant bacteria, and greatly potentiate the antibiotic effects. (Cell Metabolism, 2015). Based on this finding, we analyzed and compared the drug-sensitive and -resistant bacterial strains, and identified glutamate as an even more potent metabolite to cooperate with antibiotics. Nevertheless, the molecular mechanisms underlying how glutamate increases the antibiotic sensitivity of drug-resistant bacteria is unknown. Therefore, we will start this project by screening for key metabolic genes synergistic with antibiotic killing. Next, we intend to analyze the metabolic profile of bacterial extracts with the isotope-labeled glutamate, and identify other metabolic pathways associated with antibiotic sensitivity. The aforementioned research will help dissect the molecular mechanism of metabolism-mediated antibiotic sensitivity, and provide potential targets and novel approaches for the development of new therapeutics against drug-resistant bacteria.

抗生素滥用导致细菌耐药性提升的问题在我国日益严重，不仅给临床治疗带来困难，而且对公共健康造成极大威胁。申报人之前的研究成果表明: 丙氨酸、葡萄糖以及果糖等代谢物可促进细菌对抗生素的摄入, 从而增强抗生素对耐药菌的杀伤 (Cell Metabolism , 2015)。在此基础之上，我们通过对耐药菌和敏感菌的分析对比，鉴定出具有更显著协同杀菌作用的代谢物谷氨酸。然而，谷氨酸提高耐药菌抗生素敏感性的分子机制尚未明确。因此，本项目一方面将从谷氨酸代谢通路出发，研究控制谷氨酸代谢的关键基因，筛选出与协同杀菌作用显著相关的代谢靶点；另一方面，将应用同位素标记的谷氨酸进行菌内的代谢分析，以进一步鉴定出与抗生素敏感性相关的其他代谢通路。以上研究将帮助解析代谢介导抗生素敏感性的分子机制，为发展针对耐药菌的新型防治方法提供潜在靶点和新型途径。

细菌耐药严重危害人类、动物的健康以及生态环境，已成为全球范围内的重大公共安全问题。尽管如此，但目前对于防治耐药菌仍十分棘手，因此，亟需寻找有效的应对措施。本项目前期通过对敏感和耐药的人畜共患菌迟缓爱德华氏菌代谢组分析，找到潜在的生物标志物——谷氨酸，发现外源添加谷氨酸能够协同抗生素高效杀菌，但相关的分子机制未知。为此，本项目采用非靶向同位素标记生物标志物示踪的代谢流、基因敲除与补救等技术路线，系统深入地研究谷氨酸如何提高耐药菌对抗生素敏感性，从而实现利用现有抗生素高效杀死耐药菌的意义，阐明代谢物如何调控能量代谢从而逆转耐药性的分子机制。研究结果表明，使用稳定同位素标记谷氨酸进行追踪，发现草酰乙酸代谢流主要流向磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸、乙酰辅酶A、柠檬酸进入三羧酸循环，而不是按照三羧酸循环途径即与乙酰辅酶A缩合为柠檬酸。进一步通过基因和蛋白水平等验证，结果发现一个新的能量代谢循环，命名为丙酮酸循环。进而详细地与经典的代谢途径——TCA循环进行比较研究，得出丙酮酸循能够调控TCA循环，并证明了丙酮酸循环的完整性和重要性，并且它不仅适用于迟缓爱德华氏菌和大肠杆菌，还适用于其他病原菌。揭示丙酮酸循环是一条完整高效的产能代谢通路，它对于调控细菌体内能量平衡发挥着重要作用。此外，本项目还采用了同位素标记的相对和绝对定量标记蛋白质组技术（iTRAQ），比较迟缓爱德华氏敏感菌和耐药菌的差异蛋白质组，从中发现丙酮酸循环在耐药菌中下调，并探讨了其与细菌产生耐药的相关性以及对其他代谢通路，如嘌呤生物合成和脂肪酸合成通路造成的影响。本项目成果不仅发现了添加外源性的谷氨酸能够重建细菌对氨基糖苷类抗生素的敏感性，还有助于深入阐明代谢物能够重编耐药代谢组逆转细菌耐药性的新机制，同时对防治多重耐药菌具有重要的理论意义，也可对现有耐受抗生素重新再利用，因而可以创建一种利用现有抗生素防治耐药菌的新策略。