阿维菌素靶向朱砂叶螨GABAR功能位点及GABA调控机制研究

Avermectins acts on γ-aminobutyric acid receptors with two different mechanisms: one is activators, and another is modulators. Abamectin can directly activate the γ-aminobutyric acid receptor and the content change of γ-aminobutyric acid is involved in abamectin resistance in Tetranychus cinnabarinus. The researches in Tetranychus cinnabarinus also revealed that there were two different mechanisms of abamectin. This difference is extremely likely resulted from the difference of action sites. Thus, present project intend to simulate the action sites of abamectin on the receptors and induce the mutant sites into the receptor genes. After expressed in Xenpous oocytes, the susceptibility of normal and mutant receptors would be detected by voltage clamp and the action mode and sites of abamectin ensured by the result. Finally, the susceptibility change of different genetic receptors would be detected before and after γ-aminobutyric acid application and furtherly revealed the regulation mechanism of γ-aminobutyric acid for effect of abamectin. The result will identify the action mode and sites of abamectin and clarify the molecular mechanism of γ-aminobutyric acid mediated abamectin resistance in mites.

阿维菌素类杀虫剂以两种方式作用于γ-氨基丁酸受体，一种是激动剂，另一种是变构剂。在朱砂叶螨的前期研究中发现，阿维菌素可作为激动剂直接激活γ-氨基丁酸受体，同时γ-氨基丁酸量变可影响阿维菌素的杀螨活性，说明阿维菌素可能也存在变构或是竞争结合的作用效果，而药剂作用模式的不同往往与其靶标作用位点的差异密切相关。因此，本项目拟采用分子对接的方法预测阿维菌素靶向朱砂叶螨γ-氨基丁酸受体的作用位点；根据预测结果突变阿维菌素潜在靶向位点后转入爪蟾卵母细胞表达，然后使用电压钳检测突变前后受体蛋白对阿维菌素的敏感性变化，确定阿维菌素的作用模式及靶标作用位点；最后，比较在加入γ-氨基丁酸前后，不同基因型受体对阿维菌素的敏感性变化，明确γ-氨基丁酸对阿维菌素作用效果的调控机制。以期鉴定阿维菌素对朱砂叶螨γ-氨基丁酸受体的作用模式、靶向位点，阐明γ-氨基丁酸介导阿维菌素抗药性的分子机制。

以朱砂叶螨和二斑叶螨为代表的农业害螨给农业生产带来极大的危害和损失。叶螨普遍具有个体小、寄主范围广、生殖能力强、繁殖速度快、易接触药剂等特点，因此极易对化学杀螨剂产生抗药性。在朱砂叶螨的研究中发现其阿维菌素抗性种群中GABA含量增加，也暗示着GABA量变可能影响阿维菌素的杀螨活性。本研究正是基于以上研究背景，以鉴定阿维菌素对朱砂叶螨GABAR的作用模式，明确朱砂叶螨对阿维菌素的抗性机制为研究目的，进行了系统深入的研究，并取得了以下研究结果。.1. GABA量变介导朱砂叶螨对阿维菌素敏感性.采用三种方法提高螨体内GABA的含量，并检测GABA含量增加后其对阿维菌素的敏感性变化。第一种方法直接喷施GABA，检测结果发现，相对于空白对照，GABA处理后的朱砂叶螨在多个浓度的阿维菌素处理下，死亡率显著下降，耐药性增加；第二种方法是使用GABA转氨酶（GABA-transferase, GABA-T）的抑制剂氨己烯酸处理朱砂叶螨，检测结果显示朱砂叶螨体内的GABA含量明显增加，且对阿维菌素的耐药性有显著上升；第三种方法是使用RNA干扰的方法抑制GABA-T，检测结果显示GABA-T基因的表达量被成功沉默后，朱砂叶螨GABA的含量显著增加，且在两个浓度的阿维菌素处理后死亡率显著下降。表明GABA的量变可介导朱砂叶螨对阿维菌素的敏感性，也暗示着阿维菌素对朱砂叶螨GABAR可能具有竞争结合或是变构的作用模式。.2.阿维菌素对朱砂叶螨GABAR的作用模式研究.GABAR对GABA的敏感，在10-3M的GABA诱导下可形成一个极大的电流；同时GABAR可在10-5M阿维菌素诱导下产生电流，但是对10-6M阿维菌素并不敏感，表明阿维菌素可作为激动剂直接作用与朱砂叶螨的GABAR。在GABA和阿维菌素先后作用或是共同作用下，GABAR电流反应明显被抑制，说明了阿维菌素可能对朱砂叶螨GABAR起变构作用。.3.分子对接严重阿维菌素作用模式.采用分子对接技术预测阿维菌素对朱砂叶螨GABAR的活性位点，发现了十一个可能潜在的靶标位点，而且与已经报道其他物种中的GABA的作用位点并不相同，暗示着阿维菌素和GABA并不存在竞争结合，该结果为阿维菌素对GABAR的作用模式为变构作用的推论提供了间接证据。