蒺藜苜蓿MAPKK Tnt1 突变体的分离及共生表型分析

This project used model legume Medicago truncatula the MAPKK Tnt1-insertion mutant materials to carry out the studies on the MAPKK biological function and regulation of MAPK cascade in legume symbiosis signal transduction process. Using reverse genetics, cell biology and molecular biology techniques and methods, MAPKK Tnt1 insertion mutant was isolated and symbiotic phenotype identified, clearly MAPKK involved in symbiotic signal transduction. By homologous sequence alignment, Medicago MAPKKK, MAPKK and MAPKs were isolated, through MAPKKK and MAPKK, MAPKK and MAPKs phosphorylated substrate identification, clarify the mechanism between the members of the MAPK cascade, understanding MAPKK and MAPK cascade of biological functions in the formation and nodule development process in the symbiotic system. Provide molecular evidence to establish the rhizobia and leguminous plants in early symbiotic signal transduction.

本项目利用模式豆科植物蒺藜苜蓿MAPKK的Tnt1插入突变体为材料，开展MAPKK生物学功能及MAPK级联在豆科植物共生信号传递过程中调控机制的研究。利用反向遗传学，细胞生物学和分子生物学技术与方法对MAPKK突变体进行分离和共生表型鉴定，明确MAPKK参与共生信号的转导。利用同源序列比对，分离鉴定出苜蓿的MAPKKK、MAPKK及MAPKs，通过MAPKKK、MAPKK与MAPKs的磷酸化底物的鉴定，阐明MAPK级联成员之间的作用机制，明确MAPKK及MAPK级联在共生体形成及根瘤发育过程中的生物学功能，为阐明根瘤菌与豆科植物早期共生信号的传递提供分子生物学证据。

MAPK级联广泛的存在真核生物中，包括，酵母，动物和植物。他们参与各种生物或者非生物的胁迫反应，激素反应，细胞分裂和发育过程。MAPK级联主要由3级级联组成：MAPKs, MAPKKs和MAPKKKs。这些激酶在生长发育及各种生理过程中的作用都有过深入的研究。本项目利用模式豆科植物蒺藜苜蓿MtMAPKK4的Tnt1插入突变体为材料，开展MtMAPKK4生物学功能及MAPK级联在豆科植物共生信号传递过程中调控机制的研究。通过反向遗传学，鉴定了MtMAPKK4的Tnt1 插入突变体。mapkk4/+杂合子自交5代都没有获得纯合突变体，但是杂合体显示生长矮小，黄化以及显著降低侵入线和根瘤数目的表型。这些研究表明MtMAPKK4在共生中起作用，但是相关的作用机制还需要研究。MtMAPKK4 和MtMAPK3/6在酵母和植物细胞内都有相互作用；绿色荧光标记的MtMAPKK4, MtMAPK3 和MtMAPK6均定位于细胞膜，细胞质和细胞核。我们也检测MtMAPKK4, MtMAPK3 和MtMAPK6在根瘤发育时期的在各个器官的表达量，这三个基因在根瘤发育的早期呈现下调表达的模式。MtMAPKK4 介导的MAPK级联影响植物的生长和发育，但是其它方面的生物学功能还需要进一步检测。另外，根瘤菌和寄主植物建立的共生关系后可以逃避寄主的防御反应，我们建立了一个寄主，根瘤菌和病原菌的体系来研究植物免疫和共生关系的相互作用。丁香假单胞DC3000作为病原细菌，可以引起蒺藜苜蓿A17叶子变黄的症状。根瘤菌Sm2011和丁香假单胞DC3000可以诱导相似的免疫反应，并且根瘤菌可以特异地抑制DC3000引起的免疫反应。共接种根瘤菌Sm2011和DC3000可以抑制鞭毛蛋白受体FLS2，病程相关蛋白PR10 和转录因子WRKY33基因的表达；同时也抑制共生相关标志基因NIN和 NPL的表达，同时减少侵入线和根瘤数目。这些均表明防御反应影响共生关系的建立。另外，防御相关的基因MAPK3/6, RbohC 和WRKY33显示暂时和快速的上调表达，但是在早期共生建立后就下调表达。这些研究明确了MAPKK及MAPK级联在共生体形成及根瘤发育过程中的生物学功能，为阐明根瘤菌与豆科植物早期共生信号的传递以及免疫和共生的关系提供分子生物学证据。