猪环曲病毒3C样蛋白酶的鉴定及其小分子抑制剂的筛选

Porcine torovirus (PToV), as a common virus in the intestine of pigs, belongs to the Torovirinae subfamily from the Coronaviridae family within the Nidovirales order. PToV is a good model for studying the subfamily of Torovirinae and has important value of basic research. Nidovirus-encoded 3C-like protease (3CLpro) plays essential roles in virus replication and immunoregulation, which is considered to be an important target for antiviral drug. To our knowledge, thus far there has been no reports regarding the structure and function of PToV 3CLpro. Here, we propose to: (i) clone PToV 3CLpro gene sequences and identify all PToV 3CLpro cleavage sites within PToV polyprotein precursors; (ii) pinpoint the key domains and amino acids in 3CLpro that are responsible for PToV 3CLpro proteolytic activity by crystal complexes of PToV 3CLpro and substrate peptides; (iii) identify small molecule inhibitors against PToV 3C-like protease using a high-throughput PToV 3CLpro proteolytic activity assay, and investigate the action mechanism of small molecule inhibitors against PToV 3CLpro through crystal complexes of PToV 3CLpro and small molecule inhibitors. Completion of this project will provide the theoretical basis for PToV control and prevention, and reference for the studies of other viruses encoded 3CLpro.

猪环曲病毒（PToV）作为猪肠道内的一种常见病毒，属于套式病毒目、冠状病毒科、凸隆病毒亚科成员，是研究凸隆病毒亚科的良好模型，具有重要的基础研究价值。套式病毒编码的3C样蛋白酶（3CLpro）是抗病毒药物设计的重要靶点之一，在病毒复制与免疫调控方面发挥重要作用。然而目前尚无关于PToV 3CLpro结构功能的报道，因此本项目拟以PToV 3CLpro为切入点，鉴定PToV 3CLpro样蛋白酶的序列以及切割PToV多聚蛋白前体的所有位点；借助PToV 3CLpro与底物短肽的复合物晶体结构，挖掘PToV 3CLpro的酶活关键结构域及氨基酸位点；建立PToV 3CLpro酶活的高通量检测方法，筛选针对PToV 3CLpro的小分子抑制剂，并通过复合晶体结构解析小分子抑制剂抑制PToV 3CLpro酶活的具体作用机制，为PToV的防控奠定理论基础，同时也为其他病毒3CLpro的研究提供借鉴。

猪环曲病毒（porcine torovirus，PToV）作为环曲病毒亚科成员之一，是引起仔猪腹泻的潜在病原体，其基因组变异较大，存在高重组风险以及跨种传播的潜能；同时也是研究套式目病毒进化的重要环节，解析其3C样蛋白酶（3CLpro）的结构与功能，对理解套式目病毒的进化具有重要意义。为了更好地了解近期流行的PToV变异程度，以临床采集的仔猪腹泻粪便样本为实验材料进行流行病学调查，选取其中一份PToV阳性的仔猪粪样进行全基因组测序，并将其命名为PToV HB1。以PToV HB1毒株为模板，克隆预测的PToV 3CLpro及其两端侧翼序列，通过原核表达以及Edman降解法对自切割条带进行N端测序，发现成熟的PToV 3CLpro具体区域为ORF1a 3096-3382 aa。随后的定点突变实验表明，PToV 3CLpro是一种丝氨酸蛋白酶，催化中心由His53和Ser160组成。进一步利用基于环化荧光素酶的生物传感器，系统地扫描了PToV多聚蛋白的3CLpro切割位点，发现PToV 3CLpro 识别底物最典型的特征为识别底物P1位的谷氨酰胺（Gln，Q）。此外，底物P4位也相对保守，为苯丙氨酸（Phe，F）。有趣的是，与大多数套式目病毒3CLpro不同，P1-Gln残基不是PToV 3CLpro进行N端自切割的充分决定因素，而是由P1和P4残基协同影响的。随后的同源建模和生物学实验表明，PToV 3CLpro与底物之间形成了明显的S1和S4口袋，将S1（D159A，H174A）或S4（P62G/L185G）口袋的关键氨基酸突变后，PToV 3CLpro切割底物的能力完全丧失，证实S1和S4口袋在蛋白酶切割底物过程中起到重要的作用。在此基础上，构建了基于细胞的PToV 3CLpro酶活检测方法，并利用该方法筛选天然产物库中可特异性靶向PToV 3CLpro的抑制剂，发现4种天然产物能显著抑制PToV 3CLpro的蛋白酶活性。进一步选择抑制活性强、细胞毒性小的白藜芦醇（3,4',5-三甲氧基-反式二苯乙烯，MR-3）进行后续研究，发现MR-3除了抑制PToV 3CLpro酶活外，还能抑制冠状病毒PEDV和动脉炎病毒PRRSV 3CLpro的蛋白酶活性，且呈剂量依赖性，提示MR-3极有可能是针对套式目病毒3CLpro的广谱抑制剂。