机械力对组织工程心脏瓣膜种子细胞MSCs的生物学效应及其机制研究

研制组织工程心脏瓣膜（TEHV）是心脏瓣膜外科的重要研究方向,但目前仍面临很多困难。我们在构建TEHV的研究中发现： BMSCs作为TEHV种子细胞的生物学功能尚不理想，通过体外脉动反应器增加机械力作用能够改善BMSCs的功能，但仍不能承受高压高速的血流冲击。机械力对BMSCs的生物学行为影响及其分子机制对种子细胞的功能改进至关重要，但目前尚无报道。因此本课题拟1）通过功能实验研究机械力信号对BMSCs增殖、分化、凋亡、黏附等细胞生物学行为的重要作用；2）通过差异蛋白质组学技术高通量筛选BMSCs中机械力信号下游重要的靶蛋白；3）通过反向干预候选靶蛋白的作用，并结合相关功能实验阐明机械力信号对BMSCs作用的重要分子机制。本课题的完成有利于明确BMSCs作为TEHV种子细胞功能改进的关键环节，完善种子细胞体外培养环境，对构建能应用于临床的TEHV有重要的理论探索和实践指导意义。

组织工程心脏瓣膜（TEHVs）是心脏外科研究的重要方向之一，骨髓间充质干细胞（BMSCs）是重要的种子细胞来源。目前TEHVs研究的瓶颈是种子细胞在体内流体切应力作用下粘附和功能不理想，容易出现细胞凋亡、脱落，使移植失败，但是目前尚没有流体切应力对TEHVs种子细胞BMSCs活性功能影响的研究报道。因此研究流体切应力对TEHVs种子细胞BMSCs生物学功能的影响及其分子机制，对TEHVs构建具有重要的意义。本课题的研究目的是：研究出切应力对骨髓间充质干细胞增殖、凋亡及活性的影响；明确在流体切应力对骨髓间充质干细胞功能活性影响的关键蛋白质和相关基因，找到改进骨髓间充质干细胞功能的基因靶点。研究出流体切应力对骨髓间充质干细胞功能活性影响的分子机制，为改进骨髓间充质干细胞作为TEHVs种子细胞的功能奠定基础。研究发现：1、 hBMSCs的表面抗原分子CD29和CD105阳性，CD45、CD34和CD14均为阴性,能够定向诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞。2、首先研究发现低切应力（3dyne/cm2）作用较短时间（≤6h）时可促进hBMSCs增殖，hBMSCs未发生显著凋亡，同时内源性cIAP1上调；但在3dyne/cm2作用12h和10 dyne/cm2以及30 dyne/cm2流体切应力下6h时hBMSCs增殖受到抑制，细胞发生显著凋亡坏死，活性功能明显减低。切应力越大细胞凋亡坏死越显著。3、蛋白质组学研究和基因芯片的筛选，首先发现3dyne/cm2的切应力作用6h后hBMSCs细胞 AnnexinA2和GAPDH表达显著上调，有6种粘附相关基因及5种凋亡相关基因发生显著变化，其中凋亡相关基因APAF1和BOK在切应力作用下显著增强，显示hBMSCs在切应力作用下凋亡与APAF1、BOK和Caspase凋亡基因的启动相关。4、应用Caspase9抑制剂干预可降低Caspase3的活性和LDH活性，减少hBMSCs的凋亡，细胞增殖增加；加入cIAP1拮抗剂反向干预后Caspase3活性和LDH活性增强，细胞凋亡显著增加。5、首先应用外源性重组cIAP1干预可以实现抑制Caspase3的活性和LDH活性，减少hBMSCs在切应力作用下的凋亡，使细胞增殖和活性增加。