基于microRNAs芯片高通量分析的法医早期损伤时间研究

The estimation of wound age in forensic medicine can expose and justify crime, and the key of research in this field is to seek the appropriate markers with specificity and chemical stablity. Previous studies have demonstrated that microRNAs is a type of little molecular which can regulate the transcription and translation in the period of cell growth. These moleculars have a better chemical stablity and tissue-specification, which means the great potential value on estimation of wound age. In addition, the results in our research that compared with mRNAs, miRNAs show more stable under the condition of decomposition; furthermore, the different expressions of detected markers in different type and extents of injury. So this application aims to use multi-factor model to do study on microRNAs for estimation of wound age including different ages, extent and type of injury. We design to detect and screen the microRNAs expressions during the whole wound healing process by the high-thoughput method of Chip-array. Then, it check the influence on selected microRNAs markers of tissue-specification, early injury and pathological environment after death, and the temperature and humidity of the external conditions. In the end, the left markers with proof of aboved mentioned factors will be quantitation and verification by FQ-PCR and Northern Blot, ISH individually. At the same time, we can unite the results of our research on mRNAs on estimation of wound age, and establish the equation of determination of wound age.

确定损伤时间可揭露、证实犯罪，而研究的关键是寻找特异、稳定的推断指标。miRNAs是调控基因表达翻译的小分子RNAs，已被证实具有更强的化学稳定性和组织特异性；我们的研究也显示在皮肤组织腐败过程中，miRNAs较mRNAs更稳定。这些研究都表明miRNAs在损伤时间研究中具有巨大的潜在价值。同时，我们既往研究还发现：不同损伤类型、程度机体的修复过程并不一致。因此，本项目采用不同年龄、损伤类型与程度多因素研究模式，miRNAs芯片高通量筛选皮肤损伤修复过程中具有特异性和稳定表达的miRNAs指标，并对特异性、死后早期损伤与病理环境、外界温湿度等影响因素开展系统研究，寻找不受上述因素影响的miRNAs作为损伤时间推断指标，应用FQ-PCR定量分析表达水平，Northern Blot、miRNAs原位杂交技术验证，为损伤时间研究提供新的指标筛选领域，综合建立上述条件下早期损伤时间准确推断方法。

早期损伤时间的准确推断有效地区分多次损伤，其对于因多次损伤引起的刑事与民事纠纷中发挥重要的作用，也是法医病理学重要的研究内容和长期关注焦点之一。当前，虽然相关研究报道较多，但研究结果仍难以在实践中获得普遍应用。究其主要原因是缺乏对各推断指标表达的重要影响因素进行深入研究，如损伤程度、类型、生物体年龄等。通过本项目的立项与实施，我们采用自由落体方法，通过设计一套装置，建立SD大鼠下肢轻度、中度、重度肌肉挫伤实验模型，并在损伤后数小时至13天期间，重点观察损伤后修复的炎症表现和增生过程，发现重度损伤中主要参与的炎性细胞持续时间明显延长；鉴于上述表现，本研究对于不同程度损伤仍筛选出表达最稳定的内参基因，SNORD 95、SNORD 96A被证明是表达最稳定基因；针对轻度、重度肌肉挫伤，本项目采用美国Affymetrix miRNA 4.0基因芯片，在长达7天的不同时间段内，高能量分析致伤后肌肉组织炎症与修复过程中miRNAs的表达变化，结果发现差异表达基因能够全部区分轻度、重度损伤，其中有283个基因具有差异性表达，筛选出符合需要的29个表达趋势，并通过信号通路分析、网络分析等，发现这些基因涉及修复过程中的炎症反应、细胞调亡、刺激细胞变形与调控、肌肉收缩、ATP代谢等主要功能；通过上述研究结果，本项目组提出构建法医早期损伤时间推断标记物筛选原则与方法，并据此初步筛选出15个推断指标，并采用RT-qPCR技术进行验证，为早期损伤时间推断进行建立数学模型。本项目组收集老年大鼠不同程度损伤样本，将对所建立数学模型进行修正与补充。