HIF1α通过Hedgehog信号通路调节神经母细胞瘤生物学特性的机制研究

Neuroblastoma is one of common malignant solid tumor in infancy. Proliferation、apoptosis、differentiation and dedifferentiation、invasion and metastasis of neuroblastoma cell will change in hypoxic microenvironment while at the sanme time HIF-1α high expression. Hedgehog signaling pathway is very important in the occurrence and development of neuroblastoma. Previous study of our research group found:HIF-1α overexpression in clinical neuroblastoma sample;after HIF-1α overexpression gene transfected neuroblastoma cell lines the stem cell markers up_regulated, what more after cultured in hypoxic environment the stem cell characteristic of SP cells maintained for longer time. This research via overexpress HIF-1α gene and interference HIF-1α expression and using hedgehog signaling pathway antagonist cyplopamine treats neuroblastoma cell lines which have been transfected overexpression HIF-1α gene to prove that HIF-1α via hedgehog signaling pathway to influences the biological characteristics of neuroblastoma in cellular 、 molecular and mice in vivio field. This research wants to demonstrate that HIF-1α through hedgehog signaling pathway to influence the proliferation、apoptosis、differentiation and dedifferentiation 、invasion and metastasis of neuroblastoma cell, as a result, provides a new target for neuroblastoma clinical therapy.

神经母细胞瘤（NB）是幼儿期常见的恶性实体肿瘤之一。在低氧环境下HIF-1α呈高表达，神经母细胞瘤细胞增殖、凋亡、分化和去分化、侵袭转移也会发生改变。已有研究证实，Hedgehog信号通路在神经母细胞瘤的发生发展中有重要作用。本项目组前期研究显示：临床神经母细胞瘤标本中HIF-1α呈较高表达；HIF-1α基因转染NB细胞后，NB细胞干细胞标志物表达上调，低氧培养后SP细胞干性维持时间延长。本研究试图通过基因转染并基因干扰HIF-1α的方式，及Hedgehog信号通路阻滞剂处理HIF-1α转染的神经母细胞瘤细胞的方式，从细胞分子水平和动物体内试验， 证明该因子通过Hedgehog信号通路对神经母细胞瘤生物学特性的影响。旨在阐明HIF-1α通过Hedgehog信号通路对神经母细胞瘤增殖、凋亡、分化和去分化及侵袭转移的影响，从而为临床治疗神经母细胞瘤提供新的靶点。

目的：神经母细胞瘤（neuroblastoma, NB）是最常见的儿童恶性实体肿瘤之一，其总体治疗效果不佳。当肿瘤快速生长、血供不足时，其内部常产生低氧现象。低氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α）是重要的转录因子，在低氧下调节肿瘤细胞的许多生物学行为。本研究旨在阐明HIF-1α对NB生长、侵袭、去分化的影响及其作用机制。.方法：首先我们构建HIF-1α过表达以及RNA干扰的慢病毒载体。通过慢病毒转染2种NB细胞使HIF-1α过表达或基因沉默，从而研究HIF-1α在NB增殖、迁移、侵袭中的作用，并运用荧光定量PCR 和Western blotting评价HIF-1α对SHH通路的调控作用。此外，建立裸鼠移植瘤模型，在体内验证HIF-1α对NB细胞生长的影响，并用免疫组化测定临床NB标本中HIF-1α、Sonic Hedgehog（SHH）信号通路蛋白表达。最后，通过流式细胞技术，从SH-SY5Y细胞中分选出侧群（side population, SP）细胞和非侧群细胞，比较两者HIF-1α和SHH信号分子的差异。通过慢病毒转染，使SP细胞HIF-1α过表达或沉默后，运用Western blotting、免疫荧光、实时荧光定量PCR评价HIF-1α对SP细胞肿瘤干细胞标志物（ABCG2, Oct4, c-kit）表达的影响。.结果：HIF-1α在常氧、低氧下均能促进NB细胞侵袭，但仅在低氧下促进其增殖和迁移。HIF-1α在转录水平正向调节NB细胞的SHH通路，进而影响其蛋白表达。裸鼠移植瘤模型证实HIF-1α可在体内促进NB生长并调节SHH通路。HIF-1α和SHH信号分子SHH、 PTCH1、GLI1在NB标本中的阳性率分别为57.7%、64.8%、46.5%、54.9%。Spearman 相关分析显示NB标本中HIF-1α和SHH、GLI1的表达水平呈正相关，HIF-1α、SHH、GLI1的表达水平和肿瘤分期呈正相关。SP细胞肿瘤干细胞标志物（ABCG2，Oct4，c-kit）的mRNA和蛋白水平较非SP细胞明显升高，阻断SHH通路后，HIF-1α促NB细胞生长、迁移、侵袭、去分化的作用可被逆转。 .结论：本研究阐明HIF-1α通过SHH信号通路调控NB生长、侵袭、去分化等生物学行为。