基于蛋白质组学技术筛选豁眼鹅产蛋相关调控蛋白的研究

Liaoning Huoyan goose, which is one of the livestock and poultry genetic resources protection breeds of national level, has been faced with a series of serious problems, such as breeds degradation, fertility decline and germplasm resources loss. This project is intended to Liaoning Huoyan geese as the research object, combined with two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) and mass spectrometry (MS) technology to screen the proteins differentially expressed in hypothalamic-pituitary-gonadal axis system of Huoyan geese between the pre-laying and the laying period. Then by bioinformatics analysis, combined with differentially expressed gene profiles of Huoyan goose reproductive axis tissues, which are obtained from the previous research, candidate proteins associated with the Huoyan goose egg laying performance will be identified. After that, using cell culture in vitro, lateral ventricle injection and ELSIA technology, the effect of candidate proteins on the reproductive hormone secretion of cultured hypothalamic brain slices, pituitary cells, ovarian granulosa cells and living body will be studied. Finally, the functional protein, which plays an important role in the regulation of Huoyan goose egg laying performance, will be obtained. The project is the first from the proteome level to study proteins associated with the Huoyan goose egg laying performance, this research results will provide a theoretical basis for revealing the molecular regulatory mechanism of the Huoyan goose egg laying performance, guiding molecular breeding, improving the egg laying performance, protecting variety resources, and accelerating the development of goose industry, which is of important theoretical and realistic significance.

国家级畜禽遗传资源保护品种- - 辽宁豁眼鹅品种退化和繁殖力下降现象严重，面临种质资源丢失的严峻问题。本项目拟以辽宁豁眼鹅为研究对象，采用双向电泳结合质谱分析的蛋白质组学技术，筛选豁眼鹅产蛋前和产蛋期下丘脑-垂体-卵巢生殖轴系统的差异表达蛋白，经生物信息学分析，结合本项目组前期研究获取的豁眼鹅生殖轴组织的差异基因表达谱，确定与豁眼鹅产蛋性能相关的候选蛋白，分别利用体外细胞培养技术和活体侧脑室注射技术及酶联免疫技术探讨候选蛋白对体外培养的下丘脑脑片、腺垂体细胞和卵巢颗粒细胞以及活体分泌相关生殖激素的影响，从而获取对豁眼鹅产蛋性能起重要调控作用的功能蛋白。本项目首次从蛋白质组水平上研究豁眼鹅产蛋性能相关调控蛋白，研究成果将为揭示豁眼鹅产蛋性能的分子调控机制、指导分子选育、改善豁眼鹅的产蛋性能、保护品种资源、加速鹅产业的发展提供理论依据，具有重要的理论和现实意义。

本项目以辽宁豁眼鹅为研究对象，采用iTRAQ标记法结合LC-MS/MS分析的蛋白质组学技术，筛选产蛋前和产蛋期豁眼鹅下丘脑、垂体和卵巢组织的蛋白表达谱，其中下丘脑蛋白表达谱获得3337种蛋白质，垂体中3473种，卵巢中4262种；根据FDR < 0.05，iTRAQ比值为> 1.2或< 0.83的筛选标准，从下丘脑中获得差异表达蛋白34种（18种上调，16种下调），垂体中684种（418种上调，266种下调），卵巢中403种（255种上调，148种下调）；经GO注释和KEGG等生物信息学技术分析发现，这些差异表达蛋白主要分为三个主要类别，即细胞组分、分子功能和生物过程，但每种组织中筛选到的差异表达蛋白参与的生理过程各有特点，结合本项目组前期获取的差异基因表达谱，本项目重点关注与豁眼鹅产蛋性能相关的差异表达蛋白，如下丘脑中的complexin-1、EAAT2和ITPR3等，垂体中的运载蛋白1和运载蛋白2、ITPR3、催乳素、孕酮受体等，卵巢中的ApoB、RBP4、Vitellogenin-2（VTGⅡ）、载脂蛋白II（apoVLDL-II）、FABP4、CYP19A1和CYP17A1等，这些蛋白可能通过GnRH信号通路、类固醇激素生物合成、雌激素信号转导通路等参与机体的生殖、激素分泌、类固醇激素生成等生理过程；经qRT-PCR及Western blot 等技术验证分析后，初步确认这些蛋白为候选功能蛋白，它们大多呈现产蛋期表达量较产蛋前增加的现象。为进一步探讨候选功能蛋白的生理作用，课题组选择候选功能蛋白脂联素和FABP4，通过载体构建和体外过表达和干扰表达等技术进行功能验证发现，体外原核表达的脂联素重组蛋白纯化后对卵巢颗粒细胞孕酮的分泌有促进作用，但对雌二醇的分泌有抑制效果；而FABP4的过表达和干扰表达都可影响卵巢颗粒细胞的激素分泌作用，其中干扰表达可有效抑制雌二醇的分泌，过表达则促进雌二醇的分泌。由此说明脂联素和FABP4都可参与卵巢颗粒细胞激素分泌活动的调控，进而调节机体生殖活动，但具体机制有待进一步探讨。综上，本项目研究获得的蛋白表达图谱及差异表达的候选功能蛋白等试验结果将为进一步探讨候选功能蛋白的生理作用及豁眼鹅高产蛋性能形成的分子机制等科学问题奠定一定理论和技术基础。