mTERT与TYR启动子联合调控HN基因溶瘤腺病毒的构建及其对黑色素瘤靶向治疗的研究

Melanoma is a malignant tumor which has high malignity, traditional therapy and medicine for melanoma is not effective at present. As a superficial tumor, melanoma is very suitable for researching by gene therapy. Previous studies have indicated that telomerase reverse transcriptase (TERT) is a broad-spectrum specific promoter of tumor tissue and tyrosinase (TYR) promoter is a specific promoter of melanoma tissue. In this research, TERT promoter and TYR promoter were cloned into the adenovirus shuttle vector respectively, meanwhile therapeutic gene Hemagglutinin-neuraminidase (HN) was inserted into downstream of TYR promoter, finally constructed an oncolytic adenovector which could express HN gene and is regulated by double specific promoters of melanoma is only able to proliferate in the tumor cells. Following the replication of the oncolytic adenovirus, the copy number of therapeutic gene HN and the amount of its protein expression were also significantly improved. The anti-tumor effects, heredity stability and safety of the oncolytic adenovirus in animal models of melanoma will be illustrated comprehensively by detecting the cell viability and the apoptosis effect of melanoma cells, by determining the differences of protein expression levels of HN gene in different tissue, by measuring the titer of oncolytic adenovirus in the blood of animal models of melanoma while the dosage and the ways of drug administration are different to expound the gene therapy effect of this oncolytic adenovirus on melanoma.

黑色素瘤是恶性程度很高的肿瘤，传统的方法和药物对其治疗效果不佳。作为一种浅表性肿瘤，它非常适宜于基因治疗的研究。研究显示，端粒酶逆转录酶（TERT）启动子是肿瘤组织的广谱启动子，酪氨酸酶（TYR）启动子是黑色素瘤组织的特异性启动子。本研究将小鼠TERT和TYR核心启动子片段分别克隆到腺病毒穿梭载体上，同时在TYR启动子下游插入治疗基因HN，利用双启动子调控HN基因的转录，构建黑色素瘤双启动子调控HN基因表达的特异性溶瘤腺病毒，故这种经过修饰的病毒仅能在黑色素瘤细胞内增殖，并随着溶瘤腺病毒的复制使其携带的HN基因拷贝数和蛋白表达量明显提高。在不同给药剂量和途径下，通过检测溶瘤腺病毒对肿瘤细胞活力和细胞凋亡情况、不同组织中外源基因的蛋白表达水平、以及在黑色素瘤动物模型血液中的滴度等指标，综合评价溶瘤腺病毒对肿瘤动物模型的抑瘤效果、稳定性和安全性，阐明溶瘤腺病毒对黑色素瘤的靶向基因治疗效果。

项目背景：黑色素瘤是死亡率较高的恶性肿瘤，在兽医临床上常见于老龄动物，在全球范围内发病率呈逐年上升趋势，其特点是恶性程度高、进展快、易远处转移，是一种对常规治疗药物具有较强抗性，在临床治疗过程中颇为棘手的恶性肿瘤。基因治疗已成为本领域的研究热点，黑色素瘤作为一种浅表性肿瘤，非常适用于基因治疗的观察和研究。.研究内容：将鼠源 mTER和TYR核心启动子的基因片段分别克隆到腺病毒穿梭载体的多克隆位点上，同时在TYR基因启动子下游插入治疗基因HN，从而调控和启动治疗基因的转录，构建出能够稳定表达HN基因的肿瘤双启动子调控的特异性溶瘤腺病毒。通过对黑色素瘤细胞的转染试验和肿瘤动物模型的治疗试验，综合评价溶瘤腺病毒在肿瘤动物模型体内外的抑瘤效果。.重要结果：Ad-mTERTp-Tyrp-HN在体内体外均具有抑瘤作用，且具有靶向性，呈现明确的抗肿瘤治疗潜力，为黑色素瘤的临床治疗提供有效的治疗策略，为进一步利用重组腺病毒治疗疾病奠定基础。.关键数据：构建了BALB/c小鼠荷B16细胞肿瘤模型，通过尾静脉注射和瘤内注射两种方式探究 Ad-mTERTp-Tyrp-HN 对B16的抑制作用。尾静脉注射组虽然不能使肿瘤消除，但却使肿瘤生长缓慢。在尾静脉注射48h后，行冰冻切片，于肿瘤组织处可以观察到明显的绿色荧光；荧光定量PCR结果表明Ad-mTERTp-Tyrp-HN能够成倍的提高caspase-3、p21、p53的 mRNA表达量。瘤内注射组显示Ad-mTERTp-Tyrp-HN能延长小鼠黑色素模型的中位生存期，生存期长于顺铂治疗组，未引起明显的肝脏、肾脏、脾脏等组织损伤，体重并未减轻；活体成像结果表明，瘤内注射96h后，重组腺病毒仍然可在肿瘤组织处表达，并见明显分布；冰冻切片结果显示，Ad-mTERTp-Tyrp-HN表达组织的荧光强度高于对照组；通过 Western blotting 检测，重组腺病毒均上调caspase-3、p21、p53蛋白的表达水平，与荧光定量结果一致；TUNEL试验显示，Ad-mTERTp-Tyrp-HN 棕色区域占91%；免疫组化结果显示，实验组的caspase-3、p21、p53蛋白阳性率高于对照组（p<0.05）。.科学意义：溶瘤腺病毒在动物模型体内外具有靶向抑瘤作用，为比较医学和人类肿瘤的基因治疗提供新的研究思路和方法。