nsp12调控猪传染性胃肠炎病毒复制的分子机制研究

Porcine transmissible gastroenteritis virus (TGEV) is a common pathogen leading to serious economic damage to the swine industry worldwide. TGEV nsp12 encoded a RNA-dependent RNA polymerase, which is the most essential protein and responsible for genome replication and transcription, has gradually become an important target for efficient antiviral drugs design. Through sequence alignment we find that the N terminal of nsp12 is a nucleotide enzyme (NiRNA), and C terminal is a RNA-dependent RNA polymerase (RdRP), the molecular mechanism and the structural basis of nsp12 to regulate the replication of TGEV have not been elucidated. In this project, our research will focus on solving the crystal structure of nsp12 by X-ray crystallography, then the interaction and functional mutual control between nsp12 NiRAN and RdRP domains will be verified. Meanwhile, we will determine the key motifs and amino acids of NiRAN interacting with RdRP through structural analysis. On this basis, the effect of the amino acids that influence the function of nsp12 RdRP on the virus replication could be finally verified using TGEV reverse genetic system. These studies will clarify the mechanism of regulation of TGEV replication by nsp12, which will provide a new target for the development of antiviral drugs and the design of new vaccines.

猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）是严重危害养猪业的重要病原，其nsp12编码的RNA依赖的RNA聚合酶，是负责基因组转录和复制最核心的蛋白，已成为有效的抗病毒靶标。nsp12 N端是核苷酸化酶（NiRAN），C端是RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP），其调控TGEV复制的分子机制和结构基础尚未阐明。本项目拟通过X-射线晶体学方法解析nsp12的晶体结构，并通过生物化学方法验证nsp12 NiRAN与RdRP两部分功能域的相互作用及功能上的相互调控，通过结构分析确定NiRAN与RdRP相互作用面的关键氨基酸表位，并探究它们对nsp12 RdRP活性的影响；在此基础上利用反向遗传操作系统，在病毒水平验证影响nsp12 RdRP功能的位点对病毒复制的影响，从而深入诠释nsp12调控TGEV复制的分子机制，为抗冠状病毒药物研发和新型疫苗的设计提供新靶点。

猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）是严重危害养猪业的重要病原，其nsp12编码的RNA依赖的RNA聚合酶，是负责基因组转录和复制最核心的蛋白，已成为有效的抗病毒靶标。本项目成功表达了高纯度的nsp12蛋白，及其与nsp8的复合物。我们进行了nsp12及其与nsp8复合物的晶体筛选，尝试了不同长度截短，不同结晶温度等，没有观察到晶体生长。同时，我们也尝试采用冷冻电镜技术进行nsp12复合物、nsp12融合蛋白的结构解析。我们获得了均一性较好的蛋白颗粒，并收集了冷冻电镜数据但分辨率较低，这为nsp12及其复合物的结构解析奠定了基础，同时为其生化功能的研究提供了材料。同时，我们以TGEV为模型筛选靶向冠状病毒复制的抑制剂，我们发现tyrphostin A9 (A9)，一个特异性的受体酪氨酸激酶抑制剂，对TGEV有很强的抗病毒活性。此外，A9似乎是一种广谱冠状病毒抑制剂，因为其在细胞水平可有效抑制鼠肝炎病毒（MHV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）的复制。我们通过进一步探究明确了A9通过靶向受体酪氨酸激酶(RTKs)下游分子p38和JNK1来抑制TGEV高效复制。这些发现为研究宿主受体酪氨酸激酶信号通路在促进冠状病毒复制中的潜在作用提供新的视角，为设计新型抗冠状病毒药物提供了重要线索。此外，成功解析了新冠病毒SARS-CoV-2的Mpro与GC376复合物的结构，并发现nsp12的抑制剂GS441524和3C样蛋白酶的抑制剂GC376低剂量联合应用时可有效保护小鼠免受SARS-CoV-2感染，效果优于单独用药。这为新冠的临床治疗提供了理论依据。我们以FIPV为模型从FDA批准的药物库中筛选出有效的药物，我们发现Conivaptan HCl一种精氨酸加压素（AVP）V1A/V2A受体拮抗剂可显著抑制FIPV的复制，与GC376联合用药时可在细胞水平抑制病毒的复制，效果优于单独用药，两种药物具有协同抗病毒作用，这为研究抗FIPV药物奠定基础，同时为临床治疗提供具有潜能的候选方案。