鸡干扰素诱导跨膜蛋白1抑制新城疫病毒感染的分子机制

Newcastle disease virus (NDV) is an important pathogen which causes serious threats to the poultry industry; the contributions of host factors during the course of NDV infection remain largely unknown. The interferon-inducible transmembrane (IFITM) represents a kind of cellular antiviral factors that can block entry stages of diverse enveloped viruses which entry cell via endocytosis. We previously demonstrated that chIFITM1 was up-regulated during NDV infection, indicating this factor maybe involve in the infection process of NDV. In this proposal, we intend to examine the correlation between chIFITM1 and the anti NDV activity mediated by interferon. Then, the subcellular localization of chIFITM1 and NDV in cells will be determined, and the effects of chIFITM1 on the replication of NDV in cells which NDV entry through direct membrane fusion and endocytosis; as well as the effects of chIFITM1 on the specific stage of NDV infection will be examined. Based on the results above, we attempt to identify the specific ways of chIFITM1 to participate in the infection process of NDV. Finally, the site of NDV membrane fusion will be identified and the effects of chIFITM1 on the specific step of NDV membrane fusion will be investigated to elucidate the mechanisms of the effect of chIFITM1 on the invasion process of NDV. This project expects to elucidate the molecular mechanism of chIFITM1 mediated anti NDV activity of interferon.

新城疫病毒（NDV）是严重危害家禽养殖业的病原体，宿主因子在NDV感染中的作用所知甚少。干扰素诱导跨膜蛋白（IFITMs）是一种抗病毒因子，能够限制多种通过内吞途径入侵细胞的囊膜病毒的进入过程。我们前期研究发现，鸡IFITM1（chIFITM1）在NDV感染后上调表达，表明其可能参与NDV的感染过程。本项目拟首先分析chIFITM1与干扰素介导的抗NDV活性的相关性；然后通过检测chIFITM1和NDV在细胞中的定位分布，并探索chIFITM1对NDV在以直接膜融合和内吞途径入侵的细胞中的复制以及NDV感染具体阶段的影响，以明确chIFITM1参与NDV感染的具体途径；最后通过确定NDV膜融合的发生位点，并鉴定chIFITM1影响NDV膜融合的具体阶段，以揭示chIFITM1影响NDV感染入侵过程的作用机制。本项目期望阐明chIFITM1介导的干扰素抗NDV活性的分子机制。

本团队前期研究发现干扰素诱导的抗病毒蛋白家族中的干扰素诱导跨膜蛋白1（chIFITM1）在NDV感染后上调表达，表明其可能参与宿主抗NDV的感染过程。本研究证实了NDV能够刺激干扰素的产生，且I型干扰素能够显著诱导chIFITM1的上调表达。chIFITM1在不同类型细胞中的定位分布存在差异，其中仅定位于鸡巨噬细胞（HD11）早期内体中的chIFITM1能够抑制NDV在细胞中的复制，且对病毒的吸附和进入没有影响，表明其可能是限制通过内吞途径进入细胞的NDV在内体中的膜融合从而发挥抗病毒作用。使用荧光染料标记NDV后检测NDV进入HD11细胞的过程，发现NDV除了通过直接膜融合方式进入细胞，还能利用内吞通路入侵细胞。利用内吞通路抑制剂处理后发现，NDV进入HD11细胞依赖内体的酸化和动力蛋白（Dynamin II）。过表达野生型（WT）和功能突变体（DN）的Dynamin II以及敲低其表达证明了NDV通过内吞通路入侵HD11细胞需要Dynamin II的参与。用网格蛋白介导的内吞通路（CME）抑制剂处理细胞，过表达CME中关键分子EPS15的DN以及敲低网格蛋白的表达发现NDV进入HD11细胞不依赖CME。而用小窝介导的内吞通路（CavME）抑制剂处理细胞，过表达DN caveolin-1和敲低其表达能够抑制NDV的内吞性进入和复制，并且NDV和caveolin-1存在共定位，表明NDV进入HD11细胞依赖CavME。另外，用巨胞饮抑制剂处理HD11细胞，对病毒的吸附、进入、复制均无影响，说明NDV感染HD11细胞不依赖巨胞饮。进一步构建了参与早期和晚期内体运输的关键分子Rab5和Rab7的DN，发现Rab5 DN的过表达能够抑制NDV的进入，敲低Rab5的表达能够抑制NDV的进入和复制，而Rab7对NDV的进入没有影响。NDV与Rab5和早期内体存在共定位，表明NDV通过CavME进入HD11细胞，并以依赖Rab5的方式定位于早期内体。用DiOC和R18对NDV进行双重标记，评估chIFITM1对NDV与细胞融合的影响，结果发现chIFITM1能够抑制NDV在内体中的膜融合，并且其作用的是半融合和融合孔形成的阶段。本项目结果表明定位于HD11细胞早期内体中的chIFITM1能够特异性的抑制通过CavME进入内体中NDV的膜融合从而限制NDV的感染。