基于生物素-亲合素的磁性固定化复合酶在煤生物转化中的应用研究

Low-rank coal bioconversion is an important way to prepare clean fuels and chemicals.` The early low-rank coal bioconversion was undertaken using the solubilization coal bacteria by special screening, cultivation and transformation, but the conversion efficiency is susceptible to microbial growth conditions, and it's difficult to achieve continuous production. Extracellular enzymes secreted by solubilization coal bacteria play a key role in the process of low-rank coal bioconversion. This study intends to immobilize a variety of solubilization coal enzymes on the surface of the magnetic particles in order to play a multi-enzyme synergy, and achieve solubilization coal enzyme reuse, then overcome the shortcomings of susceptiblity to the impact of growing conditions and low conversion efficiency of solubilization coal bacteria. This study takes extracellular enzyme secreted by Phanerochaete chrysosporium as research object. The optimal combination of enzymes having a high biological conversion rate will be determined by a molecular biology method, and prokaryotic high expression system of dissolution coal enzyme-biotin fusion protein will be built to achieve mass production of biotinylated enzyme. Biotin labelled dissolution coal enzyme combination will be directionally fixed on the surface of avidin-coated magnetic polymer microspheres, and biotin-avidin-based complex enzyme-immobilized magnetic particles will be obtained. And then its multi-enzyme mechanism, dissolution coal activity, stability, dynamic features and applications will be further studied. The study is based on the academic frontier, and will have great practical significance for industrial application of low-rank coal bioconversion.

低阶煤生物转化是制备清洁燃料及化学品的重要途径之一。早期的低阶煤生物转化是利用专门筛选、培育、改造的溶煤菌，但转化效率容易受微生物生长条件的影响，且不易实现连续化生产。溶煤菌分泌的胞外酶在低阶煤生物转化过程中发挥关键作用。本项目拟将多种溶煤酶固定在磁性颗粒表面发挥多酶协同作用，实现溶煤酶重复利用，克服溶煤菌易受生长条件影响及转化效率低的缺点。本项目以黄孢原毛平革菌分泌的胞外酶为研究对象，通过分子生物学方法确定具有较高生物转化率的最佳酶组合，构建各溶煤酶与生物素融合蛋白的原核高表达系统，以实现批量制备生物素化溶煤酶；将带有生物素标签的溶煤酶组合定向固定在亲和素包被的磁性高分子微球表面，获得基于生物素-亲和素系统的磁性固定化复合酶，进而对其多酶作用机理、溶煤活性、稳定性、动力学特征及其应用等进行更进一步研究。该项研究立足学科前沿，对实现低阶煤生物转化技术的工业化应用具有重要的现实意义。

低阶煤生物转化是制备清洁燃料及化学品的重要途径之一。早期的低阶煤生物转化是利用专门筛选、培育、改造的溶煤菌，但转化效率容易受微生物生长条件的影响，且不易实现连续化生产。溶煤菌分泌的胞外酶在低阶煤生物转化过程中发挥关键作用。本项目主要发展一种新的低阶煤生物转化方法，通过分子生物学方法确定具有较高生物转化率的最佳酶，构建溶煤酶与亲和标签融合蛋白的真核表达系统，实现批量生产溶煤酶；以功能化磁性高分子纳米粒子为载体，通过亲和标签蛋白，实现溶煤酶与载体的特异性亲和结合，获得基于亲和结合的磁性固定化酶。将其用于低阶煤的生物转化，实现溶煤酶重复利用，克服溶煤菌易受生长条件影响及转化效率低的缺点。首先，我们通过利用 DNAMAN 软件结合 NCBI 的 BLAST-N 程序在 GenBank 数据库中进行相似性检索，确定黄孢原毛平革菌基因组中参与低阶煤生物转化反应酶的基因，通过基因工程技术合成该基因序列，利用PCR技术将6His亲和标签序列融合目的基因的5’端，进一步将该片段重组到含有Zeocin抗性的pPIC Z A表达质粒中，并将重组质粒转化入毕赤酵母中进行诱导表达，获得了6His标签融合的过氧化物酶；通过共沉淀法合成Fe3O4磁性纳米颗粒，利用硅烷化偶联试剂在磁性粒子表面引入环氧基，利用环氧基于乙二胺二乙酸的反应在其表面引入IDA的配体，从而得到表面富含Ni粒子的磁性载体；利用Ni粒子与6His标签序列的亲和结合原理，将溶煤酶从基因重组毕赤酵母表达产物中分离，从而得到基于6His-IDA亲和结合的磁性固定化溶煤酶；用该固定化酶对低阶煤进行转化，在含有H2O2的磷酸缓冲液体系中反应1 d即可将低阶煤转化15%，而且对固定化酶进行重复回收利用3次之后其转化率还在14%左右，大大缩短了生物转化低阶煤的周期，提高了酶的使用寿命。