MEPE蛋白质裂解活化在牙本质形成以及相关疾病中的作用和机制研究

细胞外基质磷酸化糖蛋白（MEPE）在机体钙磷代谢、骨组织形成及相关疾病中具有重要作用，机理不明。前期研究发现：MEPE在成牙本质细胞合成分泌过程中被蛋白质前体加工酶furin裂解，形成38kDa的C端和25kDa的N端片段，我们提出了牙本质形成中MEPE裂解活化模型以及参与家族性低血磷性佝偻病中牙本质矿化不良的假说。本研究首先制备N端和C端片段的特异性多抗和单抗，比较不同片段在牙齿发育过程中的时空表达，提示不同作用；然后采用共转染和荧光共振能量转移等方法动态观察MEPE在成牙本质细胞中裂解过程，明确裂解机理；比较不同片段在细胞增殖、分化以及牙本质形成中的作用，确定活性形式；最后分析该型佝偻病患牙中MEPE裂解活化情况，探讨此疾病中牙本质矿化不良的致病机理。本课题将阐明MEPE裂解活化过程，揭示牙本质基质蛋白翻译后修饰在牙本质形成中的作用，探讨牙本质发育性疾病的致病机理，为其防治提供思路。

本课题观察MEPE不同片段在牙齿发育过程中的时空表达，提示其不同作用；比较MEPE不同片段在细胞增殖、分化以及牙本质形成中的作用，确定MEPE的活性形式，进一步验证和充实MEPE裂解活化模型，从牙本质细胞外基质蛋白翻译后修饰的角度探讨牙本质形成的机制，为临床上牙髓病变活髓保存治疗、MEPE相关疾病的预防治疗提供理论依据。.一、MEPE不同片段在牙齿发育过程中的时空表达。大量表达、纯化MEPE不同片段原核蛋白，制备特异性识别N端和C端片段的抗体，并制备小鼠牙齿发育过程中不同阶段组织切片，通过免疫组织化学染色法，比较MEPE不同片段在牙齿发育过程中的时空表达模式。结果显示两种抗体识别的N端片段和C端片段蛋白表达定位无明显差异，提示三种形式的MEPE都可能参与牙本质形成。.二、MEPE不同片段过表达稳定细胞系的生物学特性比较。构建含有不同片段MEPE基因的慢病毒载体，包装病毒后感染成牙本质细胞建立过表达的稳定细胞系，确定功能性片段。结果表明，MEPE全长以及C端片段能促进细胞增殖，对于细胞分化和矿化具有抑制作用，而N段片段无明显作用。提示MEPE通过C端片段下调成牙本质细胞分化和矿化。.三、MEPE不同片段的细胞生物学作用。MEPE全长及不同浓度的C端片段对成牙本质细胞的增殖均有促进作用，对成牙本质细胞的碱性磷酸酶活性有抑制作用，抑制成牙本质细胞分化和矿化能力。MEPE全长及C端片段作用下ITGA2、ENAM表达上调，TGFB2表达下调，提示MEPE全长及C端片段可能通过调节下游信号通路而对成牙本质细胞的增殖、分化以及牙本质形成发挥调节作用。.四．MEPE不同片段在体外牙本质形成中的作用。利用体外羟基磷灰石矿化双膜系统模型，观察MEPE蛋白全长及C端片段在体外对磷灰石晶体形成矿化的作用。结果提示MEPE可能直接参与生物磷灰石晶体的成核。XRD结果显示加入MEPE和C端片段后衍射峰强度低于DDW对照组，提示MEPE全长及C端片段具有抑制晶体生长的作用。.五．MEPE在家族性低血磷性佝偻病患牙中的可能作用。收集家族性低血磷性佝偻病患者脱落乳牙以及正畸原因拔除的恒牙，收集牙本质基质蛋白，与正常牙齿比较，Western blot显示发现患牙牙本质MEPE全长片段很少，几乎全部裂解，同时出现低分子量片段，即15kDa-23kDa的Smear条带，提示出现异常降解。