禾谷镰刀菌特有分泌蛋白Sup2和Sup4在植物侵染过程中的功能分析

Fusarium head blight (FHB) caused by Fusarium graminearum is a destructive disease of wheat and barley worldwide。Under favorable conditions, this pathogen can cause severe yield losses and contaminate infested grains with harmful mycotoxins such as deoxynivalenol (DON) and zearalenones. Lake of understanding of effectors generated during plant-fungal interaction severely restricted the disease control and germplasms breeding. We identified 53 unique genes encoding secreted proteins in the genome of F. graminearum, and generated all the deletion mutants. Among them, two candidate effector proteins named Sup2 and Sup4 were found to be important for plant infection and had high expression levels during early infection stages. In this study, we will deeply characterized the function of the effectors during plant infection. Live-cell imaging technology will be used to detect the secretion, translocation and localization of effector proteins. The function control sequences or amino acid sites of candidate effectors will be also examined by site-directed mutagenesis. Furthermore, the wheat proteins interacted with candidate effectors will be identified by yeast two-hybrid assays and affinity purification technology. Results from this study will be conducive to elucidate the function mechanism of effectors during the plant-fungal interaction and establish theory foundation for breed germplasm with disease-resistant and FHB disease control.

由禾谷镰刀菌引起的赤霉病是小麦、大麦等粮食作物上的毁灭性病害，它不仅直接导致严重的产量损失，而且被侵染的谷粒会产生大量对人畜有害的真菌毒素，如脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米烯酮。对“禾谷镰刀菌-植物”互作过程中的关键因子（效应子）及其功能了解的不足，严重制约了病菌防治和优良抗病种质的设计和选育。我们利用生物信息学分析鉴定出53个禾谷镰刀菌特有的候选分泌蛋白，并通过基因敲除技术得到了所有基因的敲除突变体，鉴定出两个在植物侵染时期强烈表达并与致病力相关的候选效应蛋白：Sup2和Sup4。本研究将对这两个候选效应子在侵染寄主过程中的功能进行深入探索，明确它们在侵染过程中的分泌、运输及定位过程，通过定点突变找出调控其功能和定位的蛋白区段和氨基酸残基，并进一步筛选出与其互作的小麦靶蛋白，分析互作机制。研究结果将会阐明效应子在真菌-植物互作中的作用机理，为赤霉病防治和抗病种质设计选育打下理论基础.

由禾谷镰刀菌引起的赤霉病是小麦和大麦上的一种世界性的毁灭性病害。对“禾谷镰刀菌-植物”互作过程中的效应子及其功能了解的不足，严重制约着该病菌的防治和小麦优良抗赤霉病种质的设计和选育。在此研究中，我们利用生物信息学和基因敲除技术系统鉴定了禾谷镰刀菌中的50个特有的分泌蛋白的功能，从中筛选出两个重要的毒力因子和候选效应子：OSP24和OSP44。分别敲除OSP24和OSP44基因不影响突变体的营养生长、分生孢子形成、对H2O2和NaCl的压力应答、有性生殖、DON的产生和初始侵染垫菌丝的形成等，只特异性的影响其在小麦穗轴中侵染型菌丝的生长与扩展。qRT-PCR结果显示OSP24和OSP44在侵染小麦时期特异高表达。PVX系统的瞬时表达实验表明OSP24和OSP44均能够在烟草和小麦叶片上抑制Bax和InF1诱导的细胞坏死。Live-cell imaging结果显示OSP24和OSP44蛋白在侵染初期主要积累在菌丝-植物界面并且可以被运输进入植物细胞中。通过对Osp24蛋白的8个半胱氨酸位点进行点突变分析发现：第94位和第105位半胱氨酸残基对其致病力至关重要。进一步的研究显示第94位和第105位半胱氨酸残基之间可以形成分子内二硫键，并且该二硫键决定着Osp24蛋白的折叠和稳定性。接着，利用酵母双杂交技术、体外pull-down技术和双分子荧光互补技术（BiFC），我们筛选并鉴定出小麦的TaSnRK1α可能是Osp24的靶蛋白。TaSnRK1α过表达转基因小麦表现出增强的禾谷镰刀菌抗性，而沉默TaSnRK1α则表现出相反的效果。总的来说，我们筛选并鉴定出两个禾谷镰刀菌的细胞质效应子（Osp24和Osp44）并且以Osp24为对象揭示了其潜在的分子机制，证明了在协同进化过程中，病原菌可以利用孤儿基因参与与宿主之间的军备竞赛以成功侵染寄主。此研究为以后研究禾谷镰刀菌及其他真菌效应子提供了方法和思路，也为赤霉病防治和抗赤霉病种质设计和选育提供了理论基础.