鼻咽癌3号染色体中新型抑癌基因的鉴定与功能研究

Epigenetic silencing of tumor suppressor genes (TSGs) by promoter methylation is an early event in the multi-step process of carcinogenesis. Human chromosome 3 (Chr. 3) contains clusters of TSGs involved in many cancer types including nasopharyngeal carcinoma (NPC). Using Not I Chr. 3 microarray, ten candidate TSGs were found in NPC. Among them, the CpG islands in the promoter region of WNT7a (Wingless-type Mouse mammary tumor virus integration site family, member 7A) and in the intron 1 region of ITGA9 (Integrin α9) were confirmed to be hypermethylated in NPC by bisulfite sequencing. Furthermore, WNT7a and ITGA9 were downregulated in NPC clinical samples as shown by Q-PCR and immunostaining. As WNT7a and ITGA9 execute significant functions related to the tumor cell biology, it is very important to clarify their function in NPC. In the present study, we will overexpress WNT7a and ITGA9 in NPC cell lines and observe the their influence on cell growth,cell proliferation,apoptosis, invasion and metastasis in vitro, as well as tumorigensis in vivo, to clarify the function and signaling pathways of these two genes in NPC. Methylation specific PCR (MSP) and immunstaining will be performed to detect the methylation status and expression pattern in NPC clinical samples, to evaluate their clinical application for early diagnosis and prognosis prediction of NPC patients.

抑癌基因(TSGs)的启动子甲基化失活在肿瘤发生发展过程中起着非常重要的作用，而人类3号染色体中存在着大量的候选TSGs。我们先期利用针对3号染色体的NotI芯片技术筛选出10个鼻咽癌(NPC)特异性的候选TSGs，其中通过bisulfite测序发现NPC组织中WNT7a基因启动子区域和ITGA9基因第一内含子区域CpG岛存在甲基化，而且其在NPC组织中的表达也下调。提示WNT7a和ITGA9的失活在NPC发生发展过程起着重要作用。本研究拟继续在NPC细胞中过表达WNT7a和ITGA9，并观察过表达后细胞生长指数、细胞增殖和凋亡、浸润和转移、克隆形成能力等体外成瘤性，以及体内裸鼠致瘤能力等，以阐明其在NPC中的功能及分子信号通路；拟分别利用甲基化特异性PCR（MSP）和免疫组化技术检测WNT7a和ITGA9在NPC组织中甲基化状态及表达情况，并评估其作为NPC患者早期诊断、预后判断的价值。

抑癌基因(TSGs)的甲基化失活可能是癌症发生的早期事件，而检测这些TSGs的甲基化状态被应用于一些肿瘤的早期诊断。本项目旨在鉴定鼻咽癌3号染色体中的新型TSGs，评估其作为鼻咽癌患者早期诊断和预后判断的价值，并探讨研究其在鼻咽发生发展中的作用与机制。我们利用针对3 号染色体的NotI 芯片，bisulfite 测序以及甲基化特异性PCR（MSP）等技术，成功地筛选并鉴定出鼻咽癌3号染色体中的两个新型TSGs，WNT7A和ITGA9，并证实其启动子区域在鼻咽癌中存在高度甲基化。我们利用MSP技术在56% （20/36）的鼻咽癌组织中检测出了ITGA9启动子区域存在甲基化，其特异性为100%。同时我们在69% （25/36）的鼻咽癌组织中检测出了WNT7A启动子区域存在甲基化，而其特异性仅为83%。这些结果提示MSP技术检测ITGA9的甲基化状态有望成为鼻咽癌早期诊断的一个指标。进一步研发的多重甲基化特异性PCR（包括2个EB病毒编码的基因 EBNA1和LMP1，以及3个抑癌基因ITGA9， RASSF1A和 P16）检测出91% （58/64）的鼻咽癌组织标本，其特异性亦达到90%。该项技术将来有望用于鼻咽癌高危人群的筛查。此外我们利用免疫组化技术发现WNT7A在54%（68/125例）的鼻咽癌组织中呈低表达，并与鼻咽癌患者复发（p = 0.004）和转移（p = 0.021）相关，而与患者的T分期，N分期以及TNM分期无关，而且WNT7A的低表达是鼻咽癌患者无病生存的一个独立预测因子（p = 0.021）。ITGA9在 53%（64/121）的鼻咽癌组织中呈低表达，其低表达与鼻咽癌患者的T分期，N分期，TNM分期，复发与转移均无关。然而我们利用RNAi技术在鼻咽癌细胞中沉默WNT7A的表达后，发现鼻咽癌细胞的浸润转移没有明显改变。