变构EPO调节C/EBPβ促进缺血再灌注脑白质修复的分子机制研究

Ignoring the age factor and the white matter protection in most preclinical studies of cerebral ischemia may lead to the disappointing results in clinical trials to date. Reconstructed the cross-talk between microglia and neurons shown to be essential for suppressing the microglial-mediated neuroinflammation and repairing the white matter after cerebral ischemia. We constructed the mutant EPO (MEPO) containing a single amino acid mutation. Our previous results suggest that MEPO treatment improves the neurological function and integrity of the myelin sheath after cerebral ischemia in middle aged mice (8-month old) by antagonizing the activities of members of C/EBP family. In addition, our studies primarily proved that the microglial polarization plays an important role in white matter repair. Therefore, this study uses the lipopolysaccharide and interferon-γ-treated microglial and the aged cerebral ischemic mice (15-month old) to elucidate the hypothesis: MEPO may mediate neuroprotection through binding to the EPOR/βCR heteroreceptor that activates STAT3 signaling, then decreasing the C/EBPβ mRNA and protein expression in microglial cells to reconstruct the CD200/CD200R1 interaction, promoting microglial polarization toward the M2-like phenotype and oligodendrogenesis, white matter repair, finally improving cognitive and functional recovery after stroke. This study will explore underlying molecular mechanisms of its effects on preventing demyelination process and improving cognitive memory in aged mice and provide a novel insight into MEPO treatment for cerebral ischemic stroke, and a reliable basis for clinical trials of MEPO.

忽略对脑白质的保护和年龄因素是大量神经保护药物不能成功转化至缺血性脑血管病临床应用的重要原因。重建脑缺血后神经元和小胶质细胞的交叉对话，对降低小胶质细胞介导的神经炎症、促进白质修复至关重要。MEPO是我们点突变EPO后构建的神经保护药。前期发现MEPO可抑制C/EBP家族成员的转录活性，减轻中年小鼠（8月龄）脑缺血后髓鞘脱失，改善神经功能。本项目拟应用LPS和IFN-γ诱导的原代小胶质细胞炎症模型及老年小鼠（15月龄）脑缺血模型，验证假说：MEPO通过EPOR/βCR受体激活STAT3，抑制小胶质细胞内C/EBPβ的表达，重建神经元与小胶质细胞的CD200/CD200R1连接，诱导小胶质细胞表型向M2转化，加快少突胶质细胞新生，促进老年小鼠脑缺血白质修复，改善认知功能。本项目将明确MEPO减轻老年小鼠脑白质髓鞘脱失及其改善脑缺血后认知、记忆功能的作用机制，为其临床转化提供重要的科学依据。

我们之前的研究已经证实了无促红细胞生成功能的新型变构促红细胞生成素（mutant erythropoietin, MEPO）可以在脑缺血损伤后起到神经保护作用，包括促进神经新生和白质修复。本项目继续验证：1、MEPO在中年雄性和雌性小鼠脑缺血后通过作用转录因子C/EBPβ调节小胶质细胞表型，从而修复白质；2、EPOR/βCR异构二聚体对MEPO在脑缺血后发挥神经保护作用起到的关键作用；3、脑缺血后血浆中C/EBPβ的蛋白水平作为判断患者预后的生物标记物的可行性。.第一部分研究中，分别用雄性、雌性中年C57BL/6小鼠通过线栓法制作大脑中动脉栓塞模型（middle cerebral artery occlusion, MCAO)。按照5000U/kg体重每日给予MEPO和等体积的生理盐水。分别用TTC染色、神经功能评分、免疫荧光染色等方法检测MEPO对白质修复的作用。检测各处理组中转录因子CCAAT增强子结合蛋白家族（CCAAT/enhancer-binding protein family, C/EBPs）中的C/EBPα、C/EBPβ和C/EBPδ蛋白表达情况，以及小胶质细胞表型变化情况。第二部分研究中，分离小鼠原代神经干细胞并制作氧糖剥夺模型，以及制作小鼠MCAO模型，分别用免疫荧光和免疫共沉淀的方法检测EPOR/βCR异构二聚体的存在。第三部分研究中，用ELSIA的方法检测健康小鼠和MCAO模型的小鼠血浆中C/EBPβ含量，用健康人和急性脑缺血患者血浆中C/EBPβ含量和预后3个月的mRS评分做统计分析，验证两者的相关性。我们的研究结果显示，MEPO通过激活JAK2/STAT3信号通路抑制C/EBPβ在脑缺血后的表达，抑制小胶质细胞新生，并诱导小胶质细胞向M2表型转化，降低脑梗死和脑水肿程度，减少白质损伤，改善小鼠神经功能。EPOR/βCR异构二聚体对于MEPO发挥神经保护功能起到重要作用。此外，血浆中转录因子C/EBPβ的含量与患者预后相关。.综上所述，我们的研究显示MEPO可以在脑缺血损伤后保持白质结构完整性，可能的机制是MEPO通过与EPOR/βCR异构二聚体结合，抑制C/EBPβ信号通路诱导小胶质细胞向M2表型转化，促进白质修复。我们的研究揭示了MEPO在脑缺血后修复白质可能的内在机制，并且为其后用于治疗缺血性脑卒中提供了科学依据。