结直肠癌分子标记物图谱的数字化单分子检测和系统生物学研究

Colorectal cancer is the third most common cause of cancer in China, with an increase in incidence. The key points to reduce the mortality and medical costs are the early discovery, diagnosis and treat of the high-risk population. Disadvantages remain in the traditional methods such as colorectal microscopy, fecal occult blood test and protein biomarkers in peripheral blood, especially for the limited ability for early detection. Therefore, a new non-invasive method with high sensitivity is highly demanded. Previous research has clearly shown that the risk of colorectal cancer is closely related to genomic single nucleotide polymorphism (SNP) and microRNA profile in peripheral blood. Single tumor biomarkers usually show low sensitivity and specificity, while the simultaneous measurement of a panel of biomarkers may increase the diagnostic accuracy. Until now, no method has been reported using multiple SNPs and microRNAs to predict or diagnose colorectal cancer. Based on genome-wide association study (GWAS) and microRNA profiling research in our group, this project aims to study SNP and microRNA pattern in peripheral blood using systems biology approach and droplet single molecule detection method in a large scale clinical samples. We may develop combined biomarker pattern and single molecule detection method with better performance for early warning and diagnosis of colorectal cancer.

结直肠癌是我国常见恶性消化道肿瘤，发病率和死亡率呈上升趋势。对高危人群早发现、早诊断、早治疗，是降低死亡率和医疗费用的关键。结直肠癌的标准筛查方法，结直肠镜检、粪便隐血检测和外周血蛋白标记物均有其缺陷。临床需要一种新型、无创、高敏感性的标记物进行早期预警或诊断。研究表明，基因组单核苷酸多态性（SNP）和外周血microRNA的表达与结直肠癌的风险密切相关。单一肿瘤标记物往往检测敏感度和特异性不高，联合检测极有可能提高结预警和诊断效率。目前没有基于多种SNP和microRNA联合检测用于结直肠癌预警和诊断的报道。本课题拟在本团队前期结直肠癌全基因组关联分析（GWAS）和microRNA研究的基础上，对外周血多种SNP及microRNA进行系统生物学建模、数字化单分子检测和大样本临床验证，获得敏感性和特异性较好的分子标记物图谱及单分子检测方法，用于结直肠癌的早期预警和诊断。

数字PCR是生命科学和精准医疗的关键技术，具有三个突出优点：1. 绝对定量，不依赖标准曲线；2. 灵敏度高，在物理层面实现单分子级检测；3. 准确度高，对样本中的PCR反应抑制物耐受能力大大提高，适合在复杂背景中检测稀有突变。开发自主知识产权的数字PCR系统具有广泛需求。针对这一重要需求，本项目开发了微液滴数字PCR检测技术，包括微液滴生成仪，微液滴分析仪、微液滴生成检测芯片的研制及PCR数据分类算法的开发。“准共聚焦”式检测光路和全封闭的微流控芯片设计，实现了微液滴数字PCR的高精准和防污染检测。将微液滴数字PCR的数据密度分布与分水岭算法（一种图像分割方法）有机结合，提出了了密度分水岭算法，为数字PCR数据的准确、可靠、非监督自动分类新方法。提出一种对液滴微流控芯片实现快速键合和微管道表面疏水化改性的方法。该方法工艺流程简单高效，仅耗时不到10秒。相比于现有的普遍耗时在数十分钟到数小时的方法，该方法极大地提高了液滴微流控芯片的制备效率。.基于数字PCR的分子标志物检测对于重大疾病预防、诊断、治疗和预后提供决策依据。在本课题中，本项目还以糖尿病为模型，研究开发了了一种新的筛选分子标志物的方法，该方法识别了一个已知的糖尿病风险位点rs35767，并发现了一个参与了葡萄糖代谢的功能性SNP位点rs815815。.本项目上述研究成果在Analytical Chemistry等杂志发表SCI论文8篇（致谢部分已声明本自然基金81572083支持），其中5篇获得媒体（包括国家自然科学官方网页）正面报道，相关技术获得中国授权专利16项（中国发明专利4项，实用新型专利12项）。与本项目成果相关的工作在37次学术会议进行特邀报告汇报。.总之，本项目针对分子诊断的重大需求，在数字PCR技术和相关的分子标志物发现上均有重要成果，所开发的微液滴数字PCR平台提供了一种高灵敏和防污染的自动化检测装置，所发现的新的糖尿病风险位点rs35767和rs815815为潜在新型分子标志物。