ROCK信号通路调控脑缺血再灌注后小胶质细胞/巨噬细胞激活和极化的机制研究

Microglia/macrophage activation and polarization may play an important role in the pathophysiology of stroke. However, the mechanisms of the microglia/macrophage activation and polarization after cerebral ischemia and reperfusion remain unclear. Recent research shows Rho kinase inhibitor Fasudil may impel the inflammatory M1 microglia transferring into anti-inflammatory M2 cells in vitro BV2 microglia culture model. Therefore, we hypothesized that ROCK pathway may participate in regulating the microglia/macrophage activation and polarization after cerebral ischemia and reperfusion. We will first investigate the changes and effects of Rho kinase inhibitor on the microglia activation and polarization after focal cerebral ischemia introduced by middle cerebral artery occlusion and reperfusion (MCAO/R) in rats, and explore the changes of the neuropathology and neurobehavior, and evaluate the changes of the related genes and proteins in the microglia activation and polarization using the immunohistochemistry, RT-PCR and Western Blot technique. Second, we will explore the molecular mechanisms of the microglia activation and polarization after ischemic injury using the BV microglia culture and oxygen-deprivation(OGD) model, and the ROCK pathways will be regulated by ROCK inhibitor or small interfering RNA(siRNA), recombinant His-Rho A. The immunohistochemistry, RT-PCR, Western Blot, Co-Immunoprecipitation and confocal image will be used. The molecular mechanisms of improving M1 type microglia transferring to M2 type microglia will be explored after cerebral ischemia and will provide a new target and a new concept for treating cerebral ischemia.

小胶质细胞/巨噬细胞（MG/MP）激活和极化在脑卒中病理生理中具有重要作用。然而，其机制尚不十分清楚。研究表明ROCK抑制剂法舒地尔可使培养的小胶质BV2细胞由促炎性M1型转化为抗炎M2 型。据此我们推测ROCK信号通路可能参与调控脑缺血再灌注后MG/MP激活和极化。首先我们将利用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，结合神经病理和神经行为学，并利用免疫组化、RT-PCR和蛋白质印迹技术，观察法舒地尔对脑缺血后MG/MP激活和极化影响及其相关基因和蛋白的变化。其次我们利用小胶质BV2细胞氧糖剥夺模型，通过化学试剂和siRNA来调控ROCK信号通路，利用免疫组化、RT-PCR、蛋白质印迹、免疫共沉淀和激光共聚焦等技术，研究缺血性损伤后MG/MP激活和极化的分子机制，并重点探讨促进MG/MP由促炎M1型转化为抗炎M2型的分子机制，为治疗脑缺血提供新的策略和靶点。

脑卒中是一类严重威胁人类健康和生命安全的疾病，在世界范围内，已成为第二位的死亡原因，近年来大量研究证实，神经免疫炎症反应在脑缺血继发性脑损伤中发挥重要作用，其中小胶质细胞激活及极化在炎症反应中具有重要作用。本项目在前期研究的基础上进一步阐述RCOK信号通路在小胶质细胞激活和极化中的作用以及对神经再生的影响。我们的项目证实1）法舒地尔对大鼠脑缺血再灌注后神经行为学的影响：假手术组（SG）大鼠无神经功能缺损，脑缺血再灌注模型组（MG）、脑缺血再灌注生理盐水治疗组（PG）及脑缺血再灌注法舒地尔治疗组（FG）均有不同程度的神经功能缺损。2）法舒地尔对大鼠脑缺血再灌注后小胶质细胞激活和极化影响：利用RTQ-PCR技术，观察到与SG相比，FG、PG、MG三组M1型小胶质细胞标志物（iNOS、CD32、CD16、CD86）mRNA表达在脑缺血再灌注后随时间逐渐增加；而M2型小胶质细胞标志物（CD206、Arg1、IL-10、CCL-22）mRNA表达自脑缺血再灌注后1d ~3d开始增加，3d~7d达到高峰，并逐渐下降，14d时下降至缺血再灌注前水平，甚至更低。FG 与 PG、MG两组比较， M1型小胶质细胞标志物iNOS及CD32 mRNA表达在缺血再灌注后3d、7d、14d时明显降低，有统计学意义（P＜0.05﹚；CD16 mRNA表达在再灌注后7d、14d明显降低，有统计学意义（P＜0.05﹚；CD86 mRNA表达在再灌注后7d明显降低，有统计学意义（P＜0.05﹚。M2型小胶质细胞标志物CD206 mRNA表达在再灌注后3d、7d、14d FG与PG、MG两组比较明显增加，有统计学意义（P＜0.05﹚；Arg 1 mRNA表达在再灌注后3d、7d FG与PG、MG两组比较明显增加，有统计学意义（P＜0.05﹚；CCL-22 mRNA表达在再灌注后3d FG与PG、MG两组比较明显增加，有统计学意义（P＜0.05﹚。3）本研究发现给FG组14天后，缺血灶周边的神经元前体细胞比例较PG组显著升高，这个现象可能与病灶区域微环境的改善有关。.总之，我们的研究证实脑缺血再灌注后小胶质细胞的极化表型随时间发生变化，Rho激酶抑制剂法舒地尔可促进大鼠脑缺血再灌注后神经功能缺损恢复，并促进小胶质细胞表型由促炎M1型转化为抗炎M2型，针对Rho激酶进行干预可能是脑缺血治疗的一个新靶点。