基于表面增强拉曼散射技术的快速外泌体检测方法研究

Exosomes are small membrane vesicles secreted by various types of living cells and are present in body fluids，including blood，urine，and saliva etc. Exosomes contain numerous proteins, lipids, DNA, and mRAN from the cells of origin. The composition of exosomes from different type of cells is different. During theprocess of tumor growth, tumor cells release exosomes into the surrounding environments. Therefore the detection of exosomes in body fluids have contributed to early cancer diagnosis, therapeutic efficiency, and prognosis judgment. But how to quickly and easily detect exsomes in body fluids remain a serious problem. SERS is a technique of molecular vibration spectroscopy that can be used for qualitative and quantitative analysis the molecular difference at very low concentration level. We have applied the SERS technology combined with multivariate analysis for detection human serum and screened prostate cancer. On theses bases, we plans to employ ordered metal structure as SERS substrates technology to detect the tumor-deprived exosomes based on SERS technique combined with multivariate analysis. We will research the structure, conformation, and changes of the substance such as proteins, lipids, DNA and other substances in body fluids. An optical diagnostic technique is developed to achieve reproducibility and comparability to the results of early cancer diagnosis.

外泌体( exosome) 是由活细胞分泌的小囊泡，在血液、唾液和尿液等体液中均有分布。外泌体含有大量与其来源相关的蛋白质，DNA和脂类等分子，不同来源的外泌体在组成方面存在差异。肿瘤在生长过程中不断地将外泌体释放到周围环境中，因此检测体液中的外泌体有助于肿瘤的早期诊断、疗效评价和预后分析。然而如何快速简单的在体液中检测到肿瘤特异性的外泌体依然是一个亟待解决的问题。 表面增强拉曼散射（SERS）技术能对低浓度的分子物质进行定性和定量的检测。前期实验中，我们课题组在SERS技术的基础上结合多变量统计分析，检测和分析人血清的SERS谱，对前列腺癌进行了早期筛选。在此基础上，本项目拟采用有序结构金属基底为检测平台，SERS技术与多变量统计分析相结合，检测和分析外泌体，探索其蛋白质分子、DNA，mRNA等在结构、构象和数量上的变化。该研究有望实现疾病的早期诊断，并使结果具重复性和可比性。

外泌体含有大量与释放细胞的相关的蛋白质，DNA和脂类等分子，反映了释放细胞的组成成分。不同来源的外泌体在组成方面存在差异，成为液体活检的重要物质。为了鉴别正常乳腺上皮细胞和乳腺癌细胞来源的外泌体，本项目采用表面增强拉曼（SERS）技术检测人正常乳腺上皮细胞MCF-10A，人乳腺癌细胞MDA-MB-231和人乳腺癌细胞MCF-7来源的外泌体，以及健康志愿者血清来源和乳腺癌血清来源的外泌体。比较不同来源外泌体的SERS光谱，筛选出相应的特征拉曼谱。结果发现在800-1750 cm-1区域内，正常人乳腺上皮细胞MCF-10A来源外泌体拉曼光谱的双螺旋DNA骨架的磷酸离子PO2-的对称伸缩振动谱线出现的1065 cm-1处，而人乳腺癌细胞MDA-MB-231和人乳腺癌细胞MCF-7来源的外泌体来源外泌体以及乳腺癌病人血清来源外泌体特征谱中该峰发生红移，乳腺癌病人血清来源外泌体拉曼峰明显变宽变高。另外，相比MCF-10A外泌体，肿瘤来源外泌体中归属蛋白质肽链骨架938cm-1处的拉曼峰变弱或消失。同时发现不同来源的外泌体还表现出其自己独特的拉曼谱型。主成分分析（PCA）和线性判别技术(LDA)相结合统计分析得到的SERS光谱，筛选不同细胞来源外泌体的特征拉曼峰，以及正常人血清和肿瘤病人血清来源外泌体的特征谱带。结合PCA-LDA分析得到的灵敏度为93.5%，特异性为91.2%。此结果表明SERS技术可检测外泌体的蛋白质分子、DNA和mRNA在结构、构象和数量上的微小变化。利用PCA-LDA分析法，SERS技术可发现人正常乳腺上皮细胞MCF-10A，人乳腺癌细胞MDA-MB-231和人乳腺癌细胞MCF-7来源的外泌体的区别；以及健康志愿者血清来源和乳腺癌血清来源的外泌体的区别。基于SERS技术的外泌体检测研究有望实现疾病的早期、快速和无损诊断，并使结果具重复性和可比性。