神经元活性调控的盐诱导激酶1在癫痫发病过程中的作用及分子细胞机制研究

Epilepsy is a very common devastating brain disorder with about 1% prevalence worldwide. However, the molecular and cellular mechanisms underlying pathogenesis of limbic epilepsy remain largely obscure. Converging evidences from neurobiological studies have implicated the important role of activity-dependent gene expression during the process of epileptogenesis. Here we propose activity-regulated salt-inducible kinase 1 (Sik1) may be involved in epilepsy, based on recent findings. Our preliminary data showed that Sik1 was up-regulated by limbic seizures and deletion of Sik1 gene markedly accelerated kindling process. To further clarify the action of Sik1 in epileptic brain, we will use classic animal models of limbic epilepsy to perform a series of experiments by molecular, cellular, and immunohistological tools, and systematically explore the expression pattern, kinase activity, subcellular translocation of Sik1 in mouse brain. Then we will combine multiple research strategies, such as gene knocking-out, virus infection, and pharmacological manipulation, and so on, to determine the possible role of Sik1 in limbic epileptogenesis. Furthermore, Cre/Loxp-mediated conditional knockout, electrophysiological recording will be used to dissect out the cellular mechanisms of Sik1 function. In more detail, we will analyze the gene transcription regulation changed by Sik1, screen out key target genes, and ultimately identify the underlying molecular mechanisms by performing experiments about gene chips, mass spectrum, and molecular cloning,et al. This work will directly provide the first in vivo evidence for the biological function of Sik1 in epileptic brain and give us new insights into our understanding on the mechanisms of epilepsy. Importantly, the proposed findings will greatly help us to develop novel therapeutic targets against limbic epilepsy.

癫痫是常见的破坏性脑部疾病，但其发病机制迄今仍不够清楚。既往研究表明，活性依赖的基因表达在癫痫发生过程中发挥着关键作用。我们根据当前进展推测盐诱导激酶Sik1可能与颞叶癫痫有关，预实验发现Sik1可受癫痫发作诱导，基因敲除后Kindling进程加快。据此重要线索，我们拟使用经典的颞叶癫痫动物模型，采用分子、免疫和细胞学的方法来系统观察Sik1在癫痫脑内的表达规律、活性状况和分布变化，综合使用基因敲除小鼠、病毒感染、药理学操作等研究手段来探索Sik1在颞叶癫痫发生过程中的具体作用，进一步通过条件性基因敲除、电生理记录等策略来探讨Sik1功能的细胞环路机制，结合基因芯片、蛋白质谱和分子克隆等技术来解析Sik1相关的表观遗传修饰、靶基因转录调节改变对癫痫的调控，深入阐明相应的分子机制。本项目首次研究Sik1在癫痫脑内的功能，将促进我们对颞叶癫痫发病机制的新认识，为寻找癫痫防治新靶点提供科学依据。

癫痫是一种常见的破坏性脑部疾病，但目前对于难治性癫痫的治疗效果不佳，而癫痫发生的关键调控机理至今尚不明确。因此，深入解析癫痫发生过程中的重要分子细胞调控机制显得十分必要。本项目中，我们采用Kindling模型、戊四唑点燃癫痫模型、毛果芸香碱癫痫模型和红藻氨酸盐（KA）癫痫模型等多种经典的颞叶癫痫模型，综合运用分子生物学、药理学、组织学、遗传学和在体电生理等方面的技术，进行系了统深入的探索，主要完成了四部分研究任务：第一，我们发现Sik1基因的表达可响应癫痫发作活动的诱导，癫痫后Sik1的磷酸化活性增加、且出现亚细胞定位的改变。第二，结合药理学和基因操作实验手段干预Sik1基因的活性和表达，发现抑制脑内Sik1的激酶活性、敲除Sik1基因均可显著加快癫痫发作进程，且增加了小鼠的脑兴奋性。第三，使用Cre/LoxP系统介导的条件性敲除策略，成功制备Sik1条件性基因敲除小鼠，分别在不同类型的神经元中敲除Sik1基因，结果发现，在CaMKIIα阳性的兴奋性锥体神经元敲除Sik1能加快癫痫发作进程，增加癫痫小鼠的脑兴奋性；而在包括小清蛋白阳性神经元在内的GABA能中间神经元中敲除Sik1基因，癫痫模型的进程无明显变化；进一步在海马齿状回颗粒细胞中敲除Sik1，纯合子小鼠癫痫发作明显加快；这些结果提示了海马颗粒细胞中的Sik1在对癫痫发生可能起主要的调控作用。第四，结合PP-GC通路在体LTP实验发现敲除Sik1基因，小鼠海马突触可塑性增强，且海马齿状回颗粒细胞中的Sik1起主要的影响作用，这说明Sik1可以通过突触后效应发挥对神经元兴奋性传递的调控作用，进一步的分子生物学实验表明Sik1可能是通过磷酸化II类HDAC来发挥该作用的。综上，本研究发现Sik1是颞叶癫痫发生进程中的一个关键的调控因子，海马齿状回颗粒细胞是Sik1发挥调控癫痫作用的关键靶标。本研究揭示了颞叶癫痫发生发展过程中一个新的重要调控机制，深化了我们对癫痫的病理发生和内在调控机理的认识和理解，也为更好地预防和治疗癫痫提供了新的细胞学和分子学靶标。