ABC转运蛋白对粘虫幼虫固醇吸收的调控机制研究

Cholesterol is cellular membrane component in most organisms. It modulates and regulates permeability, thermomechanics, lateral diffusion, and protein function. Insects lack the key enzyme, squalene synthase, in the sterol biosynthetic pathway which exists in yeast, plants and vertebrates. Insect herbivores therefore acquire this essential nutrient from plants. Cholestanol is one of the sterols found in plants and it differs from cholesterol only by lacking a C5 double bond.Insects cannot convert cholestanol into cholesterol and the incorporation of large amount of cholestanol can affect insect performance negatively or even lead to the death of insects. Lepidopteran insects can absorb cholesterol and cholestanol with different efficiency, which is related to the structure of these two sterols. In previous studies, we proposed that ABC transporters were involved into this process in lepidopteran insects. Based on these results, using Mythimna separata（Walker）as the model organism, we design experiments to study the role of two ABC transporters in regulating sterol absorption. The effects of inhibiting the expression of these transporters will be examined. The results will help illustrate how insects handle different sterols in food. At the same time, the genes involved in this process can be the potential new target for pest control.

胆甾烷醇是胆固醇的固醇类似物。尽管在分子结构上胆甾烷醇仅比胆固醇少一个5位双键，但是他们的功能截然不同。在昆虫中，胆固醇是细胞膜重要组成成分，但过量摄入胆甾烷醇会引起细胞渗漏从而导致昆虫生长发育缓慢甚至死亡。鳞翅目昆虫对胆甾烷醇的吸收率低于胆固醇，但其调节机制尚不明确。申请人前期实验结果显示两个ABC转运蛋白（ABC Transporters）在固醇吸收过程中可能起到了关键调节作用。本项目拟以粘虫为研究对象，通过现代分子生物学技术，阐明目的基因在不同组织中的表达模式。然后，利用CRISPR/Cas和RNAi技术干扰目的基因表达，并通过气质联用仪测定粘虫对胆固醇和胆甾烷醇吸收率的变化，从而揭示目的基因在粘虫固醇吸收中的可能作用。本项目以期阐明昆虫固醇吸收调控体系的关键因子，为完善昆虫固醇代谢理论提供基础资料， 对建立和发展以干扰固醇代谢为手段的害虫防控技术具有重要科学意义和应用价值。

本研究分析确认了粘虫和棉铃虫体内负责固醇营养吸收调控的关键因子ABC转运蛋白和NPC1b蛋白及其分子机制。主要研究内容和结果总结如下：.1、对粘虫无固醇人工饲料进行了改良，为研究固醇等微量营养对粘虫生长发育的影响提供了基础。.2、RNA干扰对于粘虫和棉铃虫的ABC转运蛋白基因的表达几乎没有抑制作用，我们建立了粘虫CRISPR/Cas9技术体系。通过实验确认了适合粘虫的取卵时间和取卵方法，并建立了粘虫独特的注射技术。.3、结合2代和3代高通量测序的方法对粘虫进行了转录组测序，通过系统发育树分析了包括棉铃虫、果蝇和小鼠在内的不同生物的ABC转运蛋白同源性。粘虫中与哺乳动物中负责固醇吸收调控的ABC转运蛋白的同源基因为Mse10895和Mse4624；棉铃虫中为HarOG200353和HarOG200354。但这四个基因均不是肠道高表达，且敲除后不影响固醇吸收。因此，推断这些基因可能不参与粘虫和棉铃虫的固醇吸收调控。.4、对粘虫和棉铃虫中肠道高表达的ABCG家族基因进一步筛选和功能验证，发现粘虫Mse1046和棉铃虫HarOG200342敲除后，粘虫和棉铃虫饲喂胆甾烷醇后体内总固醇含量升高，但饲喂胆固醇后体内总固醇含量无变化，因此，确认这两个基因分别负责粘虫和棉铃虫的固醇吸收调控。这两个基因为同源基因，非常保守，序列一致性高达97.78%。这两个基因分别在粘虫和棉铃虫幼虫的马氏管中表达最高，在肠道中也均有一定的表达量。.5、分析了NPC1基因在粘虫和棉铃虫吸收食物中固醇营养的重要功能，确认了粘虫和棉铃虫均有两个NPC1同源基因NPC1a和NPC1b，其中，NPC1b基因肠道高表达且显著高于NPC1a基因。敲除NPC1b基因影响固醇营养的吸收并造成幼虫生长发育停滞并死亡。. 上述研究明确了食物中的胆固醇和胆甾烷醇通过肠道顶端膜通道NPC1b蛋白进入粘虫和棉铃虫肠道细胞；而胆甾烷醇可通过肠道细胞或马氏管上的ABC转运蛋白（Mse1046/HarOG200342）排回到肠道腔内并被排出体外。这些信息完善了昆虫固醇代谢的机理与机制，为绿色环保的新型害虫防控技术开发提供新靶标。