文冠果游离核胚乳败育的细胞及分子机理研究

Xanthoceras sorbifolium, a precious tree native to north China, is grown for seed oil but limited for industrial development due to its low fruit-set rate. My previous studies revealed that the syncytial endosperm aberrantly developed and then aborted in some of the ovules of X. sorbifolium, resulting in the abortion of zygotes and ovules. Based on the previous works, this project will focus on the studies of abortion of the syncytial endosperm and investigate (1) the cytological characters of syncytial endosperm in different developmental stages, using light and electron microscopy, to reveal the submicroscopic structures that firstly become aberrant and result in endosperm abortion; (2) the effect of the level of reactive oxygen species (ROS) on syncytial endosperm development through microscopic measurement of ROS and different treatments of developing ovules; (3) the transcriptomics of syncytial endosperm through the combination of laser capture microdissection and RNA-Seq technology to reveal the expression of ROS network genes and other key regulation genes of cell growth and division; (4) the functions of key genes that regulate the ROS pathway in the aberrant development of syncytial endosperm, using RNA in-situ hybridization, heterogeneous overexpression and RNA interference technique. The goal of these studies is to discover the cytological and molecular mechanisms of the syncytial endosperm abortion in X. sorbifolium. This project will not only fill the gap of researches in syncytial endosperm abortion in plant embryology, but also will be of significant value for improvement of fruit-set of X. sorbifolium.

文冠果是我国北方珍贵的木本油料植物，但坐果率低成为制约其产业发展的瓶颈。前期研究发现，在文冠果部分胚珠内，游离核胚乳首先出现异常而后败育，导致合子及胚珠败育。本项目首次聚焦游离核胚乳的败育问题，拟开展：（1）采用光学及电子显微技术研究不同发育时期游离核胚乳的细胞学，揭示哪些细胞亚显微结构首先出现异常而导致胚乳败育；（2）通过显微检测和不同试剂处理胚珠，研究活性氧（ROS）与游离核胚乳发育的关系；（3）通过激光显微切割和高通量测序技术，研究游离核胚乳特异细胞的转录组学，揭示ROS相关网络基因及其它细胞重要调控基因的表达；（4）基于转录组数据，选择异常发育胚乳中调控ROS途径的关键基因若干个，通过原位杂交、异源超表达或RNAi技术研究这些基因的功能。通过以上研究，阐明游离核胚乳败育的细胞及分子机理。本项目不仅填补植物胚胎学对游离核胚乳败育研究的空白，而且对提高文冠果坐果率研究也有重要价值。

文冠果在受精后胚珠发育早期，合胞体胚乳正常发育，但在合子分裂之前大多数胚珠的胚乳游离核停止分裂，然后败育。游离核胚乳败育导致合子不能分裂，最终胚珠败育。本项目的研究目标是，通过多种途径研究文冠果受精后的胚珠发育，解析胚乳败育的细胞及分子机制。细胞学研究显示，在胚乳合胞体败育开始，内部的线粒体、内质网及高尔基体结构发生异常变化。末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）实验显示，在正常发育胚珠，靠近胚乳的珠心组织的细胞核呈现TUNEL阳性，表明这个区域的珠心细胞正进行程序性细胞死亡（PCD）。在败育胚珠的珠心细胞，TUNEL阳性核分布较多。正常发育与异常发育胚珠的比较转录组学研究共鉴定818个差异表达基因。在差异表达基因中，我们鉴定了与PCD和衰老相关的多个重要转录因子基因，如AP2-EREBP、MYB、NAC等。也鉴定了与蔗糖运输相关的基因（如SWEET家族、SUC家族）和磷酸缺乏诱导的差异表达基因（如MYB62、WRKY6、和GPT）等。RT-PCR分析证实了这些基因的差异表达模式。基于转录组学研究，我们发现5个与受精后胚珠发育相关的超氧化物歧化酶基因（SOD），其中包括2个CuZnSOD、2个FeSOD、1个MnSOD和1个CuZnSOD伴娘基因（CCS）。我们克隆了XsFSD1和XsMSD基因5’-flanking序列，分析了它们的启动子序列及其顺式作用元件。研究了超氧化物歧化酶基因在受精后不同发育时期胚珠的差异表达及其编码的酶的活性。通过病毒诱导基因沉默技术和在拟南芥异位转基因表达，研究了XsMSD基因功能。并且通过RNA原位杂交研究了XsMSD基因在受精后胚珠中的时空表达。结果表明，XsMSD与受精后胚珠的早期发育密切相关，该基因低水平表达将直接导致胚乳和胚珠败育。