柿子提取物解蛇毒关键级分的结构表征和作用机理研究

对柿子单宁的结构、性质进行深入研究是解决当前柿子深加工瓶颈和科学阐释其药理功效的基础。课题组在前期研究中建立了一种柿子单宁分离纯化的新方法并发现柿子高分子量单宁在体内外均具有显著的解蛇毒功效。本项目拟在前期工作基础上，对柿子单宁提取物进行纯化分级，采用动物实验和分子生物学技术进一步确证其显效级分的解蛇毒功效；并进一步采用HPLC、硫解HPLC-ESI-MSn,GPC, MALDI-TOF-MS、高场1D和2D NMR、X-射线衍射等分析和鉴定技术确定柿子高分子量单宁的单体组成、连结方式、聚合度、聚集态结构；研究其构效关系和作用机理，为解蛇毒新型药物的设计和开发提供理论参考，也为从根本上解决柿子产业开发难题提供理论依据。

对柿子单宁的结构、性质进行深入研究是解决当前柿子深加工瓶颈和科学阐释其药理功效的基础。课题组在前期发现柿子单宁在体内外均具有显著的解蛇毒功效的基础上，进一步对柿子单宁提取物的分级工艺进行了研究，通过体外实验和体内实验筛选了柿子单宁解蛇毒作用的显效级分，采用HPLC、硫解HPLC-ESI-MSn,GPC, MALDI-TOF-MS、NMR、FT-IR, CD等分析技术确定柿子单宁解蛇毒显效级分的分子量、单体组成、连结方式、聚合度等结构信息。采用动物实验和分子生物学技术进一步确证了其显效级分的解蛇毒功效；以蛇毒蛋白中广泛存在的PLA2为靶标，探讨了其作用机理。结果表明：（1）柿子单宁粗体物经过B型大孔树脂脱糖后再再用AB-8树脂进行初步分级，在此基础上再采用TSK-HW50F分级，能获得平均聚合度分别为2.61,23.4和33.7的三个单宁级分。初步的体内外实验表明，在这3个级分中，聚合度为23.4的级分（PT40）解蛇毒效果最显著。（2）首次确定和柿子单宁的末端结构和其分子中的A型连接，发现柿子单宁解蛇毒显效级分有着不同于其它水果单宁的独特结构：①末端基团含有C，EGCG和杨梅素，特别是非常罕见地以杨梅素作为末端基团；②延伸端结构为EGC，EGCG，EC和EGC，较其它来源的缩合单宁有更大的异质性；③分子中原翠雀定（PD）结构含量高达58.68％；④分子中棓酰化程度高达90％。⑤C4位为4β构型；⑥ 除了含有B型连接外还含有大量A型连接。（3）解蛇毒作用研究表明PT40能明显抑制蛇毒蛋白中蛋白质水解酶、L-氨基酸氧化酶、磷脂酶A2等酶的活性，且呈明显的剂量效应关系。体内动物实验表明其在3倍于蛇毒蛋白的剂量给药时对江浙腹蛇、尖吻腹蛇、眼镜蛇染蛇毒小鼠的死亡时间有显著的延迟作用，且存活率分别提高60%、70%、40%。机理研究表明PT40能显著抑制蛇毒所致的出血毒性，肌肉毒性，神经毒性均有显著的保护作用。此外，我们的研究表明柿子单宁对对蛇毒中PLA2具有特殊的亲和力，且能竞争性地夺取已被BSA结合了的柿子单宁，能显著地诱导酶结构和构象的改变，并能通过共价修饰PLA2分子中的赖氨酸氨基酸残基，引起酶结构改变，进而降低其催化活性和毒性，这为阐述其在复杂生物体内解蛇毒作用的机理提供了一条新途径。