miRNA-576靶向调控HIF-1α/HMGB1信号通路在肺缺血再灌注损伤自噬中的作用及机制研究

The differentially expressed miRNA-576 and its target gene HIF-1α involved in autophagy mTOR pathways are the key mechanism to regulate autophagy pathway in lung hypoxia reoxygenation. With stable expression of RFP-LC3 and GFP-LC3 in rat alveolar epithelial cells, alveolar macrophages and rats as the research object, the model of hypoxia reoxygenation, rat orthotopic lung transplantation/lung ischemia-reperfusion model respectively in vitro and in vivo, miRNA-576 and target gene HIF-1α regulate the expression of HMGB1 and PD-L1 in autophagy of lung ischemia reperfusion injury, involved in cellular apoptosis, inflammation and immune response and mitochondrial autophagy pathway. And by adenovirus transfection, inhibition or promotion of miRNA-576, HIF-1α, HMGB1 and PD-L1 gene expression, to intervene on the pathway, explore its mechanism and protective effect on lung ischemia reperfusion injury. To explore the possibility and mechanism of reasonable intervention of the above signal pathway to prolong the survival time of lung transplantation. Accurate regulation of miRNA and target gene signaling pathways can reduce the lung ischemia-reperfusion injury, expansion of the lung donor pool, and provide a new target and novel therapeutic approach for the treatment of lung injury and protection of lung function.

利用生物信息学技术筛选肺缺氧复氧差异表达并与自噬mTOR通路相关的miRNA-576及靶基因HIF-1α。分别以稳定表达RFP-LC3、GFP-LC3的大鼠肺泡上皮细胞系、肺泡巨噬细胞系及大鼠为研究对象，建立细胞缺氧复氧、大鼠左肺原位肺移植缺血再灌注模型，分别从离体细胞、在体大鼠两个层面研究miRNA-576及靶基因HIF-1α调控HMGB1及PD-L1在肺缺血再灌注损伤自噬中的作用及机制，涉及细胞凋亡、炎症反应、免疫应答及选择性自噬等信号通路。并通过腺病毒转染，分别将miRNA-576、HIF-1α及HMGB1、PD-L1等基因低表达或过表达，对上述通路进行干预，探讨其对肺缺血再灌注损伤的保护作用及调控机制。探索合理干预上述通路延长肺缺血保存时限的可能性及机制。精准调控miRNA及靶基因信号通路，减轻肺缺血再灌注损伤，扩大肺供体库，为防治肺损伤、保护肺功能提供新的靶点及治疗策略。

肺移植是有效治疗终末期肺部疾病的主要手段，有效预防和治疗肺移植过程中肺缺血再灌注损伤，对提高肺移植成功率及移植后远期生存率，具有重要的临床意义。自噬和炎症在肺移植相关损伤中发挥重要作用。自噬参与细胞重塑、分化、衰老和死亡等多种生物过程，作为一种新的细胞程序化死亡方式在维持细胞内环境稳态中起重要作用。我们建立稳定表达pmRFP-LC3的大鼠肺泡上皮细胞（CCL-149）细胞系和大鼠巨噬细胞(NR8383)细胞，应用不同浓度自噬的抑制剂、激活剂处理上述转染细胞，确定合理的药物浓度。建立上述转染细胞的缺氧复氧细胞模型；研究自噬通路在缺氧复氧过程中的变化及相互作用。根据自噬通路在细胞缺氧复氧过程中的变化特点，探讨给予自噬抑制剂、激活剂对其进行合理干预的可能性及可能机制。建立肺小鼠肺缺血再灌注损伤模型，研究自噬在动物模型中的作用和可能机制。在巨噬细胞缺氧复氧损伤中HIF-1a、PD-L1、TNF-α、TRAF-6、caspase-3、PINK-1、PARK2、BNIP3、BCL-2、bax等多个自噬和凋亡指标基因表达上调。然而实验中miR576作用结果不理想，我们团队对课题进行了修正，对肺损伤炎症进行深入的研究。构建了STING敲降质粒及STING低表达稳转细胞系，研究结果发现，STING缺乏缓解了LPS诱导的小鼠肺急性损伤，并抑制巨噬细胞的炎症和氧化应激反应。同时STING敲除后NLRP3炎性小体的激活程度明显降低。此外，LPS处理巨噬细胞后，细胞线粒体DNA（mt-DNA）明显增多，mt-DNA的增多触发STING的磷酸化，激活了cGAS-STING信号通路，这是LPS导致急性肺损的主要作用机制。同时我们还发现多种miRNA在肺损伤中发挥重要作用。其中，CircC3P1通过调节miR-21减轻败血症诱发的急性肺损伤，MiR-122-5p通过调节肺微血管内皮细胞中的DUSP4 / ERK信号传导来预防急性肺损伤。这些结果说明自噬、炎症、miRNA和cGAS-STING信号通路在肺损伤中发挥重要作用。肺损伤涉及细胞凋亡、炎症反应、免疫应答及选择性自噬等信号通路，肺上皮细胞，肺泡巨噬细胞和血管内皮细胞相互窜扰和相互作用在肺损伤中发挥不可忽视的作用。