高频电疗法对HIF-1介导的骨髓间充质干细胞归巢促进骨折愈合的作用及机制研究

High frequency electric therapy (HFET) has been widely used in the adjuvant therapy for fracture clinically. However, the mechanism of HFET is still unclear. Considered as the source of repairing cells, bone mesenchymal stem cells (BMSCs) homing is observed at the beginning of fracture repairation. Deficiency of BMSCs recruitment causes poor healing. In addition, the expression of hypoxia induced factor 1 (HIF - 1) can be induced by the local formation of the low oxygen environment and cause the up-regulation of BMSC homing related genes. Our previous researches revealed that migration of cell was promoted in electromagnetic field. Further study revealed improved migration of BMSCs and up-regulation of hypoxia inducible factor-1 (HIF-1) in osteotylus under the irradiation of microwave. Therefore, we assumed that HFET promotes fracture healing by enhancing BMSCs homing. To identify the influence of HFET on BMSCs homing, the process will observed by flow cytometry and fluorescence imaging. The mechanism of BMSCs homing induced by HFET will be studied by microRNA interference targeting HIF-1 in co-culture with osteoblast and BMSC. The results of the current study will provide new evidences for the HFET in the therapy of fracture, and make the combined treatment of HFET and BMSCs possible.

高频电疗法被应用于临床促进骨折愈合，但机制尚不明确。骨髓间充质干细胞（BMSC）是骨折修复的重要细胞来源，BMSC局部募集不足影响骨折愈合。此外，骨折局部形成的低氧环境可诱导缺氧诱导因子-1（HIF-1）的表达，从而上调其多种BMSC归巢相关基因加速骨折愈合。既往研究表明外界电磁场可促进细胞的定向迁移，我们的预实验也发现高频电照射后BMSC迁移加快，同时骨痂内HIF-1表达上调，故提出高频电以HIF-1作为靶点通过促进BMSC归巢而加速骨折愈合的科学假设。本研究拟采用流式细胞术及荧光成像术追踪BMSC归巢，验证骨折愈合过程中高频电对BMSC归巢的影响；外模构建成骨细胞与BMSC共培养体系模拟归巢，检测高频电诱导归巢相关因子的表达，并通过microRNA抑制HIF-1阐明高频电疗影响BMSC归巢的机制。本研究将为高频电疗促进骨愈合提供新的理论依据，为高频电疗结合BMSC治疗骨缺损提供支持。

我们通过前期研究发现高频电照射后BMSC迁移加快，同时骨痂内HIF-1表达上调，故提出高频电以HIF-1作为靶点通过促进BMSC归巢而加速骨折愈合的科学假设。为了验证科学假设进行两部分实验：第一部分：高频电诱导骨折愈合过程中 BMSC 归巢的在体观察。构建高频电治疗股骨干骨折大鼠模型，并采用X线及Micro-CT对骨折愈合进行评估。建立裸鼠骨折模型，采用荧光活体成像术及免疫荧光追踪骨折愈合过程中BMSC归巢。采用ELISA和RT-PCR检测归巢相关因子表达。影像学结果表明高频电促进骨折愈合。小动物活体成像活体、免疫荧光结果组间差异显著，表明高频电促进BMSC的归巢。ELISA结果表明高频电上调血浆SDF-1α浓度，7天时组间差异显著。骨痂组织RT-PCR结果3天时HIF-1各组间差异显著，7天时HIF-1、SDF-1、F-actin各组间表达差异显著，结果表明高频电促进HIF-1及下游SDF-1、F-actin表达。第二部分，探索在高频电场中 HIF-1 对 BMSC 归巢的影响机制。高频电预照射成骨细胞，建立BMSC与成骨细胞共培养体系，加入氯化钴模拟缺氧环境，以模拟骨折局部环境募集BMSC 归巢，采用划痕法和traswell小室进行体外迁移实验，体外验证高频电对BMSC 迁移的影响。采用siRNA下调成骨细胞HIF-1α表达，在该培养体系中进行的归巢分子机制研究。划痕实验及transwell小室实验结果表明，高频电预照射的成骨细胞上清可以提高BMSC的体外迁移能力尤其在氯化钴模拟缺氧环境中表现明显，并且可以被siRNA-HIF-1所抑制。ELISA结果表明，高频电可以上调成骨细胞上清中HIF-1和SDF-1浓度。RT-PCR及westernblot检测结果表明，高频电预照射成骨细胞上清可上调共培养BMSC 中SDF-1、CXCR4、p-FAK、F-actin的表达，而这种上调可以被siRNA-HIF-1抑制。结论：本研究结果表明，高频电促进骨折愈合，可能通过HIF-1介导的骨髓间充质干细胞的归巢而实现。