基于HuR调控为靶点的“麝香保心丸”血管生成活性成分及分子作用机制研究

"Shexiang Baoxin Pill" is the national basic drug and the large variety of traditional Chinese Medicine for the clinical treatment of angina coronary heart disease and myocardial infarction caused by myocardial ischemia with a history of more than 30 years. Pharmacological experiments showed that "Shexiang Baoxin Pill" can promote angiogenesis, but its pro-angiogenic pharmacodynamics substance and mechanism of angiogenesis are not very clear. The early study of applicant at the Yale University was found that the RNA-binding and -stabilizing protein HuR plays a critical role in the regulation of angiogenesis during inflammation or ischemic pathological conditions, which promote angiogenesis through posttranscriptional regulation of angiogenic factor-encoding mRNAs, special regulation of VEGF mRNA, to lead promote the corresponding gene expression and increase protein release, and promote the occurrence of angiogenesis. Based on the existing pharmacodynamics substance of "Shexiang Baoxin Pill" in the treatment of coronary heart disease, the project will study on the pro-angiogenic active components of "Shexiang Baoxin Pill" and molecular mechanism of angiogenesis based on HuR as a new target for the regulation of angiogenesis, according to the regulation mechanism of "HuR-VEGF mRNA stability -VEGF- angiogenesis". The research work of this project was not found in domestic and foreign literatures, has the innovation significance.

“麝香保心丸”为临床治疗心肌缺血引起的冠心病心绞痛、心肌梗死的中药大品种，临床应用30余年，为国家基本药物。药理实验表明“麝香保心丸”具有促进血管生成作用，但是其促进血管生成的药效物质基础及作用机理不甚清楚。申请人前期在耶鲁大学的研究发现在炎症或缺血病理条件下RNA 稳定结合蛋白HuR对血管生成起到关键的调控作用，这种作用是通过在基因转录后调控血管生成因子mRNAs 稳定性，特别是调控VEGF mRNA 稳定性而促进相应基因的表达和蛋白释放增加，而促进血管生成的发生。本课题基于HuR调控血管生成的新靶点，根据“HuR-VEGF mRNA 稳定性-VEGF-血管生成”的调控机制，在已有的对“麝香保心丸”治疗冠心病的药效物质基础研究的基础上，深入系统地进行“麝香保心丸”促进血管生成活性成分及分子作用机制研究。该研究工作在国内外未见文献报道，具有创新意义。

本课题基于RNA结合蛋白HuR对血管生成的调控作用，根据“HuR-VEGF mRNA 稳定性-VEGF-血管生成”的调控机制，在已有的对“麝香保心丸”(SBP)治疗冠心病的药效物质基础研究的基础上，深入系统的进行“麝香保心丸”促进血管生成活性成分及分子作用机制研究。首先通过建立的体内动物模型对SBP进行促血管新生作用的研究，发现SBP促进炎症性血管新生模型（PVA Sponge Implantation Model）小鼠VEGF-A mRNA表达、VEGF蛋白释放和微血管形成，促进小鼠股动脉结扎模型(Hindlimb Ischemia Model)新生血管形成和血流恢复，防止急性缺血组织坏死。体外细胞实验发现SBP通过激活巨噬细胞显著增加血管内皮细胞mRNAs和与血管生成相关蛋白的表达，SBP通过激活巨噬细胞，导致内皮细胞增殖、迁移和小管形成。SBP通过激活巨噬细胞，显著增加下游PI3K/Akt和MAPK/Erk1/2信号通路中p-Akt和p-Erk1/2蛋白的表达。SBP促进巨噬细胞HuR蛋白的核质穿梭。同时，在细胞水平上采用qRT-PCR方法对SBP的入血成分中的主要单体化合物进行VEGF-A mRNA的活性筛选，发现人参皂苷（Ra1、Rb1、Rg1）、麝香酮（Muscone）、苯甲酸苄酯、肉桂酸、桂皮醛7个活性较好的化合物，其中以麝香酮的活性最好。研究还发现Muscone作用巨噬细胞24 h后的巨噬细胞上清液也能够促进内皮细胞增殖、迁移、小管形成，并且能够促进内皮细胞VEGF、bFGF、MMP-9 mRNA表达及蛋白分泌，尤以VEGF-A最为显著。体外细胞实验结果表明SBP很可能是通过调节巨噬细胞分泌VEGF-A进而影响内皮细胞的功能从而发挥促血管新生作用的，其中Muscone可能是SBP组成成分中最主要的促血管新生活性成分。该研究为中药及其有效成分促血管新生机制的深入研究提供了方向。