多发性硬化相关microRNA和靶基因鉴定及其对Th17和Treg细胞生成及分化的作用

研究表明Th17细胞数量增加及功能活跃，Treg细胞功能减弱可导致MS发病和病情进展,本课题以能在转录后水平诱导靶基因降解或翻译抑制，定量调控基因表达的miRNA分子为切入点，首先通过miRNA阵列方法进行病例对照分析，确定MS发病和病情变化时Th17与Treg细胞内特异性表达的miRNA，结合生物信息学方法预测并鉴定miRNA靶基因和蛋白；进一步构建特异性miRNA正义及反义慢病毒载体，转染EAE小鼠，在体内明确其与Th17和Treg细胞之间的量化关系；然后体外进行CD4+T细胞培养，在细胞水平上进一步观察特异性microRNA,分别在特定细胞因子TGF-β（Treg细胞形成必须）；IL-6和TGF-β（Th17细胞形成必须）的作用下对Th17与Treg细胞生成、分化的调节作用；以期发现参与调节Th17和Treg细胞分化，转化和失衡的特异miRNA及其调控机制，为临床防治MS提供新的靶点

多发性硬化是一种由CD4阳性T细胞等免疫细胞介导的自身免疫性中枢神经系统脱髓鞘疾病。miRNA是一类内源性的、进化上高度保守的短单链非编码RNA分子，通过抑制或降解mRNA负调节基因表达。miRNA介导免疫调节、炎症反应、细胞凋亡和分化等多种重要生物学过程，在患病个体中出现表达差异并影响疾病的发生和发展。本项目着重于鉴定多发性硬化中表达异常的miRNA，预测并验证及其调控的靶基因，并研究miRNA-mRNA靶向调控对于CD4阳性T细胞的分化、Th17-Treg细胞平衡和对实验性自身免疫性脑脊髓炎模型的影响。课题组通过运用低密度芯片和高通量测序技术对多发性硬化患者与健康对照组的淋巴细胞进行人类miRNA的测定，并通过PCR技术分析miRNA的表达丰度及差异，确定了复发-缓解型多发性硬化的miRNA表达谱。我们发现多发性硬化患者的循环中存在多种miRNA表达异常，并具有作为新的诊断生物标志物的潜质。生物信息学方法预测miRNA调控包括RORγt等多个淋巴细胞关键转录因子，且预测的靶基因富集于多条疾病相关信号通路。进一步通过建立miRNA的正反义慢病毒载体，感染流式细胞术分选的T细胞亚群和实验模型小鼠，我们证明了hsa-let-7f等miRNA对Th17关键因子RORγt以及Th17/Treg细胞的分化与平衡具有调控作用。本项目首次建立了我国多发性硬化患者miRNA的特异性表达谱，找出一系列与多发性硬化具有密切相关性的miRNA，并初步得到多发性硬化患者miRNA靶向调控网络；鉴定miRNA调控T细胞分化的关键基因，验证了其对Th17/Treg细胞的调控作用和对实验性自身免疫性脑脊髓炎动物模型的影响。从而阐明miRNA在多发性硬化发病中的可能作用机理，并为开展新的靶向治疗方法奠定了研究基础。