新型超声微泡介导靶向Survivin基因siRNA治疗原发性肝细胞癌

原发性肝细胞癌的有效治疗是目前医学领域亟待解决的问题。利用RNA干扰技术导致靶基因mRNA降解和基因沉默是当今治疗肝癌的新热点，关键是如何将靶向性siRNA简便、安全、高效、可控地导入组织或器官中。本项目在前期成功制备长循环脂质超声造影剂的基础上，利用正负电荷的相互吸引作用或采用生物素-亲和素-生物素连接的方法，优化脂质体纳米粒耦连到超声微泡上的条件；利用高机械指数诊断超声破坏微泡提高肿瘤区微血管通透性，探讨利用诊断超声介导基因转染的优化条件；在新型超声微泡载体系统的基础上，综合运用多种载体及靶向技术介导Survivin siRNA靶向治疗肝细胞癌。项目研究是对项目组原有超声微泡载体系统的改进和发展，预期会有效克服目前超声微泡介导药物靶向传输或基因转染的局限性，并探索性地应用于肝细胞癌的基因治疗,为进一步应用奠定实验基础。

背景及研究意义：原发性肝癌是常见的恶性肿瘤类型，其发病率和死亡率不断升高。肝癌治疗有效方法的研究一直没有取得显著进展。基因治疗癌症近几年迅速发展，得到广泛关注。如何安全有效的将基因运送到体内，成为目前亟需解决的关键技术。随着分子影像学技术的发展和造影剂制备工艺的改进，超声靶向破坏微泡（UTMD）为携基因治疗恶性肿瘤提供了一种有效的非病毒途径，具有广泛的应用潜力，并逐渐成为国内外研究的热点。将超声微泡造影剂作为一种新型基因载体，可以实现靶向性治疗且不存在额外的免疫原性，显示出一定优势，为肿瘤治疗开辟了新路径。.研究内容：本研究运用EGFP荧光DNA质粒和本科室研制具有国家专利的脂氟显微泡。从体外细胞实验方面，采用临床常用的低强度超声治疗仪，通过优化超声强度、占空比、时间等影响超声“声孔效应”的重要参数，以达到增加基因转染率和减少对细胞损伤的目的。随后，利用正负电荷吸引的原理，将表面携带负电荷脂氟显微泡与阳离子的脂质体耦连，增加基因的携带量，并促进其与微泡的黏附，随后超声辐照下微泡破裂产生声孔效应，进一步提高进入细胞的基因量。在动物体内实验方面，通过对不同机械指数、不同超声辐照时间以及不同微泡剂量对诊断超声联合微泡条件下提高肿瘤血管通透性的影响，优化此技术应用的参数；初步探讨诊断超声联合微泡技术引起肿瘤血管通透性改变的细胞及分子生物学水平的机理。同时使用超声联合微泡介导survivin siRNA治疗对裸鼠皮下移植肝癌的进行相关实验研究。.结果：通过优化参数可以得到较高的转染率。超声强度为1.2W/cm2时，转染率和死亡率优于A组其余各亚组；占空比为20%时，转染率和死亡率优于B组其余各亚组。当超过90s后继续增加时间，对于转染率和细胞死亡率的影响无明显统计学意义（P>0.05）。联合运用超声微泡与脂质体，可以在不增加细胞死亡数量的前提下，得到比单独使用脂质体更高的转染效率。微泡对转染有重要作用，不添加微泡时转染效果会有大幅度降低。. 机械指数、微泡浓度、超声辐照时间均是影响诊断超声联合微泡提高肿瘤血管通透性的主要因素；诊断超声联合微泡提高肿瘤血管通透性增加的机制主要是影响血管内皮细胞活性和通透性而实现的。超声联合微泡介导survivin siRNA治疗对裸鼠皮下移植肝癌有较好的疗效，是一种提高化疗药物的生物利用度的新方法。