新型嗜酸乳杆菌食品级载体系统的构建及其在出血性大肠埃希菌O157:H7活载体疫苗研制中的初步应用

In recent years,frequent outbreak of Escherichia co1i O157:H7 infection appearls for more urgent attention in related vaccination research. Lactic acid bacteria expression system is widely used in foreign purpose gene expression which is an ideal mucous membrane immune antigen transmission carrier, but there is no report about vaccine constructed with lactobacillus acidophilus .We constructed a recombinant Lactobacillus acidophilus that expresses high levels of O157 translocation intimin receptor(Tir),on this base,in this study we will start to work as follows: (1) Constructing the lactic acid bacteria food grade carrier with food-grade selection markers replace lactic acid bacteria pMG36e plasmid of erythromycin resistance gene; (2) Constructing nutrition defect type complementary lactobacillus acidophilus host/carrier system on the bacteria nutrition defect type complementary principle; (3) Constructing new food grade O157 bivalent lactobacillus acidophilus live vector vaccine with O157 Tir and secretory protein EspA as candidates and evaluating its safety, stability and immunogenicity in vitro; (4) Establishing O157 infected BALB/c mice model and immuning mice with the vaccine candidate strain by intramuscular injection, dripping nose, oral three ways to test cells and humoral immunity level .At last, determining the best way of immunity and evaluating its safety, immune prevention effect, function mechanism and feasibility . In general,it would explore a new way for the study of O157 vaccines.

近年来大肠埃希菌O157:H7感染频频暴发，因此迫切需要进行相关的疫苗研究。乳球菌表达系统广泛用于表达外源目的基因，是黏膜免疫抗原传递载体的理想选择，但尚无嗜酸乳杆菌构建疫苗的报道。本课题在前期成功构建高效表达O157紧密黏附素受体tir的重组嗜酸乳杆菌基础上，①用食品级筛选标记替换乳酸菌质粒pMG36e的红霉素抗性基因，构建乳酸菌食品级载体；②利用细菌营养缺陷型互补原理，制备食品级嗜酸乳杆菌宿主/载体系统；③从O157 Tir和分泌蛋白EspA两个关键黏附定植功能蛋白出发，构建O157新型双表位食品级嗜酸乳杆菌活载体疫苗候选株，体外评价其安全性、稳定性及免疫原性；④建立O157感染BALB/c小鼠模型，将疫苗候选株通过肌肉注射、滴鼻、口服三种途径免疫小鼠，测试细胞和体液免疫水平，确定最佳免疫途径，通过攻毒保护实验评价其安全性、免疫预防效果及可行性，为O157疫苗的研制探索一条新的途径。

肠出血型大肠埃希菌O157:H7为人畜共患病，临床可引起出血性肠炎、溶血性尿毒综合症。目前对EHEC O157:H7感染尚缺乏有效的防治措施，尽管大部分抗生素可将其杀灭，但也会增加并发溶血性尿毒综合症的危险。鉴于O157:H7 暴发流行的严重性和抗生素治疗的危险性，安全有效的疫苗是预防其感染的首选。Tir和EspA在O157:H7黏附和形成A/E损伤的效应分子传递中起到重要的桥梁作用，若阻断O157：H7细菌感染的黏附起始阶段则可以避免和擦拭性损伤的发生，从而终止感染。乳酸菌表达系统广泛用于表达外源目的基因，是黏膜免疫抗原和药物传递载体的理想选择，但迄今为止，国内外未见嗜酸乳杆菌表达O157:H7抗原的研究报道。本研究选择espA和Tir两个关键性定植功能蛋白候选抗原，同时构建具espA-Tir-M融合蛋白为抗原的亚单位候选疫苗和以嗜酸乳杆菌为抗原投递系统的活载体候选疫苗菌株，考察两种类型候选疫苗的保护效果。亚单位疫苗采取皮下和滴鼻两种免疫免疫方式，结果表明滴鼻免疫比皮下免疫可更好的诱导小鼠产生较高水平的特异性IgG和SIgA，滴鼻免疫可提高IL-4、IL-10和IFN-γ的表达水平，而皮下免疫仅能提高IL-10和IFN-γ的表达水平，此外，滴鼻免疫的保护率高达90%，病理切片也显示滴鼻免疫可有效预防O157：H7对肠道的损伤，而皮下免疫的保护效果则较差。重组嗜酸乳杆菌活载体疫苗体外实验表明该菌株对机体细胞安全无致死作用，而且可预防性排斥94% O157:H7黏附细胞，竞争性排斥60% O157:H7黏附细胞，并且可阻止O157:H7细菌对肠道细胞的A/E损伤。体内实验表明该菌株可诱导小鼠产生较高水平的IgG和SIgA，提高小鼠血清中IFN-γ、IL-4和IL-10的表达水平，对小鼠的保护率达80%，并且可有效地缩短粪便排菌量和排菌时间，病理切片显示有效降低O157：H7引起的A/E损伤。本研究首次构建了新型双价espA-Tir-M融合亚单位疫苗，小鼠实验表明该亚单位疫苗滴鼻免疫可有效刺激机体产生保护性免疫反应，可有效预防O157：H7对肠道的A/E损伤，该双价抗原可作为O157:H7候选抗原。此外，我们首次将espA-Tir-M抗原成功转入嗜酸乳杆菌表达系统中，构建了口服的活载体疫苗，该活载体疫苗可有效地表达espA-Tir-M抗原，安全有效，可诱导机体产生特异性