转导产甲酸草酸杆菌frc基因于双歧杆菌以治疗肠源性高草酸尿的可行性研究

高草酸尿是尿结石形成和复发的最重要因素之一，而肠源性高草酸尿又占重要比例。食物中的草酸经肠道吸收是尿液草酸的重要来源，是形成尿草酸钙结石的重要原因。产甲酸草酸杆菌依赖frc基因表达的甲酰辅酶A转移酶来代谢草酸。因产甲酸草酸杆菌较难以在肠道寄生，很难通过服用产甲酸草酸杆菌活菌来起到抑制肠源性高草酸尿的作用。受使用双岐杆菌活菌来调节肠道菌群的启发。本研究，拟通过分离、克隆产甲酸草酸杆菌的frc基因，再构建frc的原核转染载体pGEX-4T-1-frc，通过该载体将frc转导入双岐杆菌中。确定转染的双岐杆菌稳定携带frc基因并表达甲酰辅酶A转移酶，获得代谢草酸的能力。再以此双岐杆菌活菌喂养肠源性高草酸尿动物模型，使得双岐杆菌寄生于模型结肠中，成为其正常益生菌群，以起到抑制肠源性高草酸尿的作用。实验若成功，则证明采用转基因的方法构建可代谢草酸的双岐杆菌作为口服的活菌药物对治疗肠源性高草酸尿的可行性

背景和目的： 尿路结石发生率呈上升趋势，而结石的复发率并没有因为治疗方法的进步而降低。高草酸尿是尿路结石形成和复发的最重要危险因素之一。东方人群日常植物性食物比例高，一般认为植物性食物中草酸含量相对较高，其经肠道吸收可导致肠源性高草酸尿。我们拟研究通过动物模型的方式建立肠源性高草酸尿模型并证实植物性食物导致高草酸尿的风险。寻找方法防治肠源性高草酸尿，对降低尿路结石形成和复发的风险，具有重要的研究意义。已有研究发现存在部分动物及人体内的产甲酸草酸杆菌具有代谢草酸作用，其代谢草酸依赖frc基因表达的甲酰辅酶A转移酶（FCoAT）等活性酶。因产甲酸草酸杆菌较难以在肠道大量定殖，不适合经服用产甲酸草酸杆菌活菌来达到抑制肠源性高草酸尿的目的。受使用双歧杆菌等益生菌来调节肠道菌群的启发。课题组试图找到或者构建携带草酸代谢基因并表达相应活性酶的肠道益生菌，或者构建具有代谢草酸能力的新型可增殖细胞以改造脏器功能，为探寻抑制肠源性高草酸尿的可行方法奠定研究基础。.结果和意义： .通过采用定量菠菜汁灌胃、经粪尿分离大鼠代谢笼收集24小时尿液，成功构建了肠源性高草酸尿的大鼠动物模型。该模型的成功构建，有力证明了多量进食草酸含量高的植物性食物，可导致肠源性高草酸尿。该动物模型也是国内首个以常用食物为基础的肠源性高草酸尿模型。.在课题研究中发现，已有研究证实自然存在携带草酸分解基因的乳双歧杆菌，具有良好的代谢草酸能力，并已逐步进行实际应用，因此已没有通过转基因方法构建新双歧杆菌的必要。但是课题组在成功培养产甲酸草酸杆菌、并获得其基因组的基础上，克隆Frc基因，构建该基因的原核表达载体PGEX-4T-2-Frc，以基因工程手段成功将载体携带的Frc基因转入益生大肠杆菌Nissle 1917(E.coli Nissle 1917,EcN)，并表达FCoAT，成为具有代谢草酸潜能的新型益生大肠杆菌EcN。研究也证实可以通过基因工程改造肠道益生菌，使其具有代谢草酸的能力。.此外，课题组在获得产甲酸草酸杆菌基因组的基础上，构建真核表达载体pLEGFP-N1-myc-Frc和pBaBE-puro-flag-Oxc，成功转染至正常成人骨髓间充质干细胞，构建可表达frc和oxc基因的骨髓间充质干细胞，能够有效表达相应的草酸代谢酶并具有代谢草酸功能，且成功进行诱导分化为肝细胞，为以后通过干细胞移植脏