X线通过MeCP2影响Axin表达与非小细胞肺癌放疗敏感性的机制研究

We found that the X-ray radiation could up-regulate Axin and increase the radiation sensitivity of NSCLC cells via down-regulating MeCP2(Methyl-CpG binding protein 2，which could down-regulate the transcription of the methylated genes), but Axin （tumor suppressor,hypermethylation could be detected in promoter）could not be up-regualted in all NSCLC cases. The mechanism is unclear. It is known that X-ray irradiation could increase HMGN1 (a responding protein of X-ray-induced DNA damage) to suppress MeCP2, and tumor suppressor Disabled-2 (Dab2) could stabilize Axin. We propose that the mechanism of Axin could not be up-regulated in some NSCLC cases and cell lines is correlated with the abnormal HMGN1 and/or MeCP2 genes and unmethylated Dab2 gene which could not be regulated by MeCP2. We intend to detect the change of HMGN1, MeCP2, Dab2, and Axin in NSCLC cell lines (treated or untreated with X-ray radiation) by Western blot, real-time PCR, pyrosequencing and other methods. We would clarify the mechanisms of X-ray could up-regulate Axin or could not up-regulte Axin by regulateing the expression of MeCP2,Dab2 and X-ray treatment, the results would provide the evidence of the clinical judgment of NSCLC patients' radiosensitivity.

我们发现X线照射可通过下调MeCP2（甲基结合蛋白2，可抑制高甲基化基因转录）、上调高甲基化抑癌基因Axin的表达而增加肺癌细胞对X线照射的敏感性，但X线照射并不能上调所有肺癌病例的Axin表达。已知作为X线-DNA损伤应答蛋白之一的高迁移率蛋白N1（HMGN1）可下调MeCP2表达，另外抑癌因子Disable-2(Dab2)具有稳定Axin作用，故我们推测：部分肺癌的Axin不能被X线上调可能与HMGN1/MeCP2基因的异常或Dab2处于非甲基化而不受MeCP2调节有关。我们拟用Western blot、定量PCR和焦磷酸测序等方法，检测X线照射及经双向调控MeCP2和Dab2的肺癌细胞中HMGN1、MeCP2、Dab2和Axin的表达，检测Dab2和Axin的甲基化状态，阐明X线照射上调或不能上调Axin表达的分子机制，为临床判定非小细胞肺癌对X线放疗是否敏感提供依据。

放射治疗是治疗中晚期非小细胞肺癌（NSCLC）的主要治疗手段,然而即使组织学类型相同的NSCLC患者对X-ray治疗的效果也是不同的，其原因仍不清楚。因此，寻找判定NSCLC患者个体是否对放疗敏感的指标，减少放射副损伤具有重要的实际意义。Wnt 信号通路是调节细胞增殖、分化的重要信号传导通路之一，我们前期的研究表明肺癌中Wnt通路异常激活与肺癌的恶性生物学行为关系密切。Dab2是新近研究中发现的Wnt通路抑制因子，我们的前期研究结果表明Dab2在肺癌组织中表达下调，而其启动子区异常高甲基化是其表达下调的重要原因。我们发现X-ray照射可以下调肺癌细胞中DNA甲基转移酶和DNA甲基结合蛋白的表达，因此X-ray照射可能使高甲基化的Dab2基因去甲基化，激活其转录，进而通过负向调控Wnt通路增加肺癌细胞的放疗敏感性。我们用BSP法筛选出Dab2基因高甲基化（LK2）和非甲基化的肺癌细胞系（SPC），经X-ray照射后，Real-time PCR和Western blot 检测显示LK2中Dab2基因启动子区发生去甲基化并且转录和表达水平上调，而且其下游的Wnt通路的关键分子β-catenin和Cyclin D1、MMP-7和c-myc明显下调；但SPC经X-ray照射后却没有这种象限，通过转染siRNA干扰Dab2和Axin的表达，可以显著的逆转β-catenin和Wnt通路靶基因的下调，以上结果表明X-ray通过上调Dab2负向调控Wnt通路。克隆形成和Transwell细胞侵袭实验显示，与SPC细胞系相比，LK2细胞经X-ray照射后克隆形成率和侵袭细胞数明显下调；干扰Dab2和Axin可以明显的逆转克隆形成率和侵袭细胞数的下调。裸鼠成瘤实验也发现X-ray照射后LK2细胞系成瘤能力明显下调。上述结果表明X-ray照射能使高甲基化的Dab2基因去甲基化，从而上调Dab2 的表达，进而负向调控Wnt通路并抑制肺癌细胞系的恶性表型，即高甲基化的Dab2基因可能成为肺癌放疗治疗的新靶点。