内生菌对滇龙胆道地性的影响及其机制初步研究

研究中药道地性及其形成机制是从源头解决药材优质高产问题的关键之一。不同产地药材化学成分的差异是道地性的物质基础。目前国内外对药材道地性的研究主要集中于化学成分、遗传多样性、药理作用以及生态环境(气候因子、光照、温度、土壤、水分)等方面，而对中药内环境的研究，尤其是植物内生菌在道地药材形成中的作用的研究鲜有报道。本项目在研究大量文献基础上，提出内生菌对中药道地性影响机制假说，以在云药产业开发中具有重要地位，云南道地的国家三级重点保护药材滇龙胆为研究材料，设计"两种材料、两个体系、两种探针"的研究方法，从化学、生理、酶学、基因表达等不同层次，系统分析内生菌及其化学成分对滇龙胆次生代谢化学、关键酶，营养，能量，还原力，抗逆性，道地性指标体系的影响，探讨内生菌未知生态学功能及对滇龙胆道地性影响的过程、机制和物质基础，从内生菌的角度对药材道地性科学内涵进行诠释，为药材生产实践的生物调控提供指导。

本项目以滇龙胆为研究材料，设计“两种材料、两个体系”的研究方法，从化学、生理生化等不同层次，研究了内生菌对滇龙胆的影响，探讨内生菌未知生态学功能及对滇龙胆道地性的影响，基本按计划完成。执行情况如下：.1、两种无菌材料：组培苗和无菌实生苗。结果培养基MS+6-BA3.0mg/L/NAA1.5-2.0 mg/L诱导率较高，可达98%以上，且小植株生长茁壮，叶色浓绿，10~15d 左右可萌发出不定芽，产生不定芽数达5-9个；无菌实生苗用尼龙袜或茶叶包包住，一起用升汞短时间灭菌1-2分钟，进行播种。.2、用单因素方差、聚类和主成分分析，对HPLC指纹图谱进行分析，结果：滇龙胆居群间共有特征峰较少；居群内不同植株共有特征峰较多。滇龙胆居群间龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷总含量聚类分析与HPLC指纹图谱主成分分析结果相似。 .3、道地性指数用隶属度表示：某一个特征都有一个隶属度 ，总的隶属度为各个特征隶属度的加权和，并编写了程序：genuineness0.2.m。采用专家评判法结合隶属度计算，结果表明：南涧滇龙胆道地性指数最大，达到0.91，其次是云龙0.88。.4、共培养及其结果。结果只有少部分内生放线菌和内生真菌可以和滇龙胆愈伤组织共培养，大部分不能共培养。从次生代谢产物含量和相关酶活性可以看出：滇龙胆道地性与内生菌有较大关系，但从生长势看，以及和非组培苗比较，单一菌株共培养的组培苗生长势比较弱，有的甚至黄化，并且苦苷含量小于实生苗。可能由于单一菌株的局限，或者受一些未知生态学功能影响。结果需进一步实验、统计确证。.5、菌种分子鉴定。保存菌株200多株，其中内生菌50多株，主要是链霉菌属（Streptomyces）、小单胞菌属（Micromono spora）、诺氏卡菌属（Nocardia）。.6、人才培养：团队宋艳秋晋升讲师、刘卫红和邓庆文晋升副教授。获得教育厅课题立项2项，云南省应用基础项目1项，与本课题相关本科毕业论文10篇左右，大学生科研1项，实验室开放课题3项。协助指导研究生1名，直接培养本科生50多人次。.7、学术交流：参加微生物生态学年会、微生物学年会等8人次，会议论文摘要4篇，分组报告1次。.8、成果：申请专利4项，授权3项；发表论文5篇（含3篇SCI论文），另外有2篇SCI论文在审,1本专著在申请出版中。