家蚕贮藏蛋白Arylphorin结构解析及分子降解机制研究

Synthesis, absorption and utilization of storage protein, which has been known for its importance in insect growth and metamorphosis, has always been the focus in insect research. However, the research progress of storage protein is slow and mechanism of storage protein degradation is not fully elucidated. In this work, we will use structural biology tool to resolve the structure of silkworm storage protein in Arylphorin family. Afterwards according to their structural and protease cleavege information, we will design experiments to explore the mechanisms how storage protein is degradated, uptaken and utilized in silkworm. By use of protein purification, protein crystallization, crystal diffraction and data processing, we will get the high-resolution structure data of the silkworm storage protein. And then we will look for the specific degrading enzyme for silkworm storage protein with their structural information and silkworm microarray data. By analysis of expression characteristics and hydrolytic activity of silkworm protease, the degradation mechanisms of storage protein will be understood. Using small molecule inhibitors and RNAi method to the storage protein, we will confirm the relationship of silkworm storage protein and their degradation protease. This work will provide important reference for understanding development, metamorphosis and nutrient conversion process in silkworm.

贮藏蛋白合成、吸收和利用的研究一直是人们关注的焦点，其对于昆虫的生长和变态发育都有直接的影响。针对于目前贮藏蛋白研究进展缓慢，降解吸收机理尚未完全阐明的现状，本研究将利用生物科学的前沿手段- - 结构生物学的方法解析家蚕体内Arylphorin类贮藏蛋白的结构，利用获得蛋白质结构信息及相关蛋白酶切位点信息,设计实验探究家蚕贮藏蛋白在家蚕体内的降解和吸收利用机制。实验将通过蛋白纯化，蛋白结晶，晶体衍射，数据处理，结构解析等实验手段，获得高分辨率的家蚕贮藏蛋白晶体结构数据。利用蛋白质结构信息和家蚕基因组芯片表达相关数据，找到家蚕体内贮藏蛋白特异的降解酶，分析其在家蚕体内的表达特征和水解活性，并进一步利用小分子抑制剂和RNAi干涉实验对贮藏蛋白在家蚕体内被蛋白酶的降解过程进行研究，为人们认识理解家蚕贮藏蛋白的降解吸收机制及其在发育变态过程执行的功能提供参考。

贮藏蛋白是家蚕体内十分重要的一类蛋白质，其表达量高，具有时期特异性和性别差异性。在许多鳞翅目昆虫中，贮藏蛋白甚至已经成为研究变态发育、性别分化等科学问题的经典蛋白。但是迄今为止，很少有对贮藏蛋白的结构进行鉴定，其降解机制一直也未被阐明。.本研究中，通过层析等方法，获得了大量稳定的家蚕贮藏蛋白Arylphorin，其纯度达到了90%以上。接下来，通过近2000的晶体生长条件的筛选，采用不同沉淀浓度，不同蛋白浓度等条件的对贮藏蛋白的晶体进行优化，最终获得了足够大的家蚕Arylphorin贮藏蛋白的晶体。在上海光源同步辐射实验中，得到了2.8Å的蛋白衍射数据，通过HKL2000, CCP4、Coot等软件的处理和修正，我们解析了家蚕Arylphorin贮藏蛋白的三维结构。结构的信息表明，该蛋白的分子量非常大，接近500kD, 是由Arylphorin蛋白的六聚体组成。有趣的是，该六聚体蛋白实际上是SP2/SP3形成的复合物。SP2/SP3首先形成结构稳定的蛋白质二聚体，然后三个二聚体形成蛋白质的六聚体，在蛋白质的表面分布着糖链，对蛋白质的结构的稳定起到了重要的帮助作用。进一步对蛋白质的结构进行分析，我们发现，在蛋白结构的表面分布着大量的papain的酶切位点，我们推测，Arylphorin蛋白可以被papain进行降解。生化实验的结果表明，不管是外源的papain还是家蚕体内的papain都对家蚕贮藏蛋白具有降解作用，这一结果证实了我们的推测。利用结构域比对分析，我们找到了具有papain结构域的家蚕半胱氨酸蛋白酶，并对该类蛋白酶进行了分析，结果表明，家蚕体内有约10种具有papain结构域类似的蛋白酶，它们通过某种方式进行激活，在蛹后期对体内的贮藏蛋白进行降解，而抑制剂 BmCPI可以调节该类酶的活性。至此，家蚕Arylphorin的蛋白质结构已解析，降解机制也有了突破性进展，并且在家蚕变态发育过程行为变化的分子机制有了新的研究发现，这对于推进Arylphorin的功能研究起到了十分重要的作用。相关结果发表在Protein Science、中国农业科学、生物工程学报、蚕业科学等杂志，另有相关文章被Journal of proteome research接受，2016年正式发表。