适于小麦胚品质性状改良的受精卵和原胚细胞特异表达基因的克隆与鉴定

小麦胚乳品质性状的研究已经取得了很大进展，而小麦胚品质性状的研究却十分薄弱。本研究针对小麦胚品质性状遗传控制研究的不足，以小麦受精卵和原胚细胞等对胚的发育和分化起关键性作用的细胞为对象，采用我们已经建立的激光显微切割技术分离单一细胞类群来解决样品的异质性问题，提取微量RNA进行体外扩增，再综合应用基因芯片杂交、消减杂交和EST技术筛选受精卵和原胚细胞特异表达的候选基因，在对候选基因进行RT-PCR、反向Northern、Q-PCR和原位杂交等RNA水平特异表达验证的基础上，克隆这两种细胞类型的特异表达基因及其上游启动子区。本研究针对胚发育关键时期的细胞，不仅可使我们更清楚地了解胚发育的遗传控制机理，还可以获得胚特异表达的基因及其启动子，为进一步利用遗传工程改良胚的大小、营养组成与含量等品质性状提供物质技术支持，对小麦品质的全面改良具有重要意义，也是现有小麦品质改良的有效补充。

小麦胚乳品质性状的研究已经取得了很大的进展，而小麦胚性状的研究却十分薄弱，本研究针对小麦胚性状遗传控制研究的不足，筛选、克隆和鉴定特异表达的基因，为进一步研究它们的功能和应用于种子性状的遗传改良提供物质基础。本项目已经完成了预期的研究目标，取得的主要研究成果如下：. 综合应用EST和芯片杂交数据筛选获得了201个小麦种子特异表达的基因，经与水稻的比较基因组分析、实时定量PCR分析证实了这些基因的表达特异性；我们很快将这一新颖的方法经改进后应用到与小麦研究基础不同的大豆中，综合应用EST和芯片杂交数据筛选获得了大豆种子特异表达的候选基因，与大豆转录组数据比较分析后获得了198个大豆种子特异表达的基因，经与拟南芥的比较基因组分析、启动子分析和实时定量PCR分析证实了这些基因的表达特异性；应用比较蛋白质组技术，对丰缺水条件下的小麦未授粉子房（含卵细胞）和授粉48小时子房（含原胚细胞）4个处理进行分析，获得了153个差异表达的蛋白质点，它们涉及能量代谢、酶类、信号转导、逆境反应等过程，反应出授粉前后基因表达谱的巨大变化；对授粉前后子房的消减杂交结果也表明基因表达谱所发生的剧烈变化，并且还有大量的未知功能基因表达，说明这一过程有许多我们所不知道的途径；通过比较基因组学的方法克隆了短柄草胰蛋白酶抑制剂基因的启动子，证明了该基因的组织表达特异性，通过比较分析发现该基因家族只存在于禾谷类物种中，且均以串联重复的状态存在，表达分析表明这些重复基因已经发生了功能的分化，经计算分析获得了发生功能岐化和适应性进化的的氨基酸位点，该结果提示我们在利用这些基因进行遗传改良时要注意选择；此外，我们还克隆了一些与品质相关的基因如维生素E合成相关基因，研究了它们的组织与逆境表达已经应用于品质改良的可能性；对大豆的一个与种子发育有关的基因进行的功能分析结果表明，该基因在拟南芥中过量表达时强烈干涉种子的发育，引起转基因植株种子败育，是种子性状改良的目的基因之一。综上所述，本研究筛选、鉴定和克隆了一大批种子（胚）特异表达的基因，这些基因再经功能验证后，即可应用于种子产量和品质相关性状的遗传改良中，提高作物产量和品质。