DOA激酶与SRm160互作对RNA剪接的影响及其在发育调控中的作用

Pre-mRNA剪接是真核生物基因表达调控的一个重要环节，对生物的个体发育起到重要的调节作用。SR蛋白是剪接复合体的一种重要蛋白组分，能够促进剪接复合体的组装、结合并识别mRNA前体中的剪接调控序列、介导位于5'和3'剪接位点的其它剪接因子间的相互作用并参与剪接后的mRNA成熟过程。蛋白激酶通过磷酸化RS结构域的丝氨酸，调节SR蛋白在剪接中的活性。本申请项目以果蝇作为实验动物，以SR蛋白家族重要成员SRm160为对象，研究对其进行磷酸化的蛋白激酶，筛选受SRm160调控的下游靶基因。本项目将通过遗传学、生物化学等方法解析果蝇中LAMMER蛋白激酶DOA与SRm160的互作，重点研究DOA激酶如何通过调节SRm160活性，调节下游靶基因的RNA剪接，从而调控高等多细胞动物的个体发育。该研究将RNA剪接调控作为蛋白激酶信号通路与个体发育的一个连接点，必将丰富发育调控的信号传导内容。

RNA剪接是真核生物基因表达的一个重要调控步骤，在高等动物的器官及个体发育中起重要的调节作用。剪接复合体中的SR 蛋白因子，能够促进剪接体的组装、能结合并识别mRNA 前体中的剪接调控序列影响剪接位点的识别、介导位于5’和3’剪接位点的其它剪接因子间的相互作用并参与剪接后的mRNA 成熟过程。蛋白激酶通过磷酸化RS 结构域的丝氨酸，能够调节SR 蛋白在剪接中的活性。本项目研究了SR蛋白SRm160在果蝇发育过程中的表达分布及其对果蝇器官及个体发育的影响，并通过遗传杂交的方法研究了SRm160与果蝇LAMMER蛋白激酶DOA调控果蝇的器官发育。研究结果表明：SRm160对果蝇个体的存活是必需基因。SRm160蛋白在果蝇不同发育阶段及各器官均有广泛表达，但 SRm160表达量的改变对不同器官的影响不同。用特异性GAL4诱导RNAi敲低SRm160表达量仅影响复眼和翅的发育。而诱导SRm160表达量上调导致雄性个体外生殖器发育异常，以及复眼发育中细胞调亡的异常增加致使复眼多种类型细胞数量减少及形态异常。体外反应中蛋白激酶DOA能够磷酸化重组表达的SRm160多肽。果蝇杂交结果也表明基因Doa与SRm160存在密切的遗传相互作用：Doa的突变能明显回复SRm160过量表达导致的复眼表型，说明SRm160蛋白的活性或稳定性受DOA磷酸化的调控。而在外生殖器则不同，Doa突变却加重了SRm160高表达造成的雄性外生殖器异常表型，说明在不同的器官发育中二者的发挥功能的机制不同。另外二者的相互作用还体现在对果蝇性别决定通路中的作用，SRm160突变加强了由Doa异等位突变体造成的雌性个体轻度雄性化的表型，说明二者共同参与性别决定信号通路。尚在进行的部分实验CLIP法探索SRm160靶标结合位点的实验已进行至高通量测序准备阶段，后续的结果分析及整理必将有助于理解该蛋白在个体发育中所调控的靶基因，进而理解其对发育过程的调控。本课题较为全面的研究了SRm160对果蝇个体及器官发育的影响，尤其讨论了SRm160与Doa基因的协同作用对果蝇发育的影响。本课题的研究结果也引申出一些新的研究兴趣点，如：复眼发育受到SRm160水平改变的精确调节，说明该蛋白对于复眼发育关键调控基因的表达有重要作用。另外进一步研究此蛋白对于性别决定通路的调控机理也将是一项有趣的研究内容。