应用外显子测序技术鉴定中国发作性睡病致病基因

Narcolepsy-cataplexy is a lifelong disabling condition affecting 0.02-0.12% of the population and it was thought to be the typical genetic model to study sleep disorder and sleep. Using a genome wide association study (GWAS) design, we found that narcolepsy/hypocretin deficiency is strongly associated with T-cell receptor (TCR) α 、TCRβ 、CHKB、P2RY11 and ZNF365 polymorphisms. However,all SNPs are located in introns of these genes and the functional effects of the genes remain to be known. In this study we will collect more than 100 multi-proband narcoleptic families，using exome sequencing to identify the pathogenetic genes and verify the gene mutation by Sanger sequecing and Real time PCR. Both unaffected family members and probands will undertake PSG and MSLT, and complete clinical manifestations. We also collect blood samples from all patients and unaffected family members. Comparing with unaffected family members，we will be able to identify the mutations that patients carry but not the unaffected family members，using Sanger sequencing to verify pathogenic genes and furthermore measure mRNA expresion by real-time PCR to exlpain the pathogenic mechanism of narcolpsy. Using model animals to demonstrate de novo mutations effect mRNA expresion.

发作性睡病以难以抑制的嗜睡、发作性猝倒、睡瘫、入睡幻觉为主要临床特点的一种独特综合征，伴有猝倒的发作性睡病人群患病率达0.02-0.16%。由于其独特的表现型，且与遗传有关，是研究睡眠疾病及睡眠本身遗传机制的重要疾病模型。我们前期进行全基因组相关性研究发现其与TCRα 、TCRβ 、CHKB、P2RY11、ZNF365 这些自身免疫相关基因有关，但GWAS 研究结果得到的候选基因SNP 位点多位于内含子区域，较难从功能学上揭示基因表达产物对疾病的影响。本研究拟通过对超过2个患者发病的100 余个家系及多患者的大家系10 余个的患者和家系成员进行全外显子组测序，寻找患者携带而家系成员不携带的基因突变，在散发病例和正常对照中进行基因验证，通过靶组织中mRNA 表达水平检测预测基因功能，并通过构建模式动物验证突变基因产物功能的改变。以期找到可以从功能学研究揭示发作性睡病发生机制的致病基因。

发作性睡病是研究睡眠疾病及睡眠本身遗传机制的重要疾病模型。本研究旨在通过对核心家系表型与基因型研究，进一步了解其遗传机制；并对多患者大家系中的患者及其家系成员进行全外显子组测序，寻找患者携带而家系成员不携带的基因突变。确定后可以在散发病例和正常对照中进行基因验证，检测靶组织中mRNA 表达水平预测基因功能以期找到可以从功能学研究揭示发作性睡病发生机制的致病基因。.课题组首先入选了符合以下条件的（<18周岁，HLA-DQB1*0602基因阳性，典型猝倒，或CSF Hcrt ≤ 110 pg/ml）的407名儿童患者；268个（66%）家系有至少一个父母参与研究。378名家长进行了问诊和问卷评估、夜间多导睡眠监测、多次睡眠潜伏期实验、HLA基因分型。4名家长进行脑脊液下丘脑分泌物1测定。3名家长MSLT结果阳性。并进行了HLA-DQB1*0602阳性和HLA-DQB1*0602阴性家长的症状比较。共发现3名（0.7%）家长伴有猝倒的发作性睡病（100% DQB1*06:02阳性），9名家长MLST阳性但是无猝倒（78% DQB1*06:02阳性）。结果提示在发作性睡病患者核心家系中，尽管0.7%家长患有伴有猝倒的发作性睡病，更多的家长虽下丘脑分泌素缺乏但具有轻度无猝倒的发作性睡病的症状。此本研究结果有力支持研究假说：许多下丘脑分泌素缺乏患者无猝倒症状，伴有猝倒的患者是疾病谱中比较极端的状态。.课题组同时进行了外显子组测序研究，先后对三个发作性睡病的多患者大家系（陈XX家系、张XX家系和杨XX家系）的临床资料进行了收集，完成了血液样本DNA的提取。采用Agilent的液相芯片捕获系统，对人的全外显子区域DNA 进行高效富集建库并进行库检，运用Illumina平台进行测序。课题组分析筛选了候选基因，最后通过后续的过库筛选，过滤千人基因组数据库，保留1000G中频率低于0.01的变异位点；保留外显子区（exonic）或剪接位点区的变异；去除同义突变；目前在已经完成的多患者家系中共26份样本的全外显子测序及分析，发现了多个突变位点，但是每个家系的发现均明显不同，其中张XX家系仅发现两个突变位点，进一步测序分析中未发现有意义的基因突变，未进行计划中的验证研究。