基于Sxc-/GPx4/ROS生物轴可灌注铁死亡诱导剂的设计合成及其抗膀胱癌活性研究

In the treatment of bladder cancer, the efficacy of pirarubicin is not satisfactory; many other chemotherapeutic agents are not suitable for intravesical instillation due to their very low water solubility. Therefore, it is urgent to develop those agents for perfusion which can effectively kill bladder cancer cells with low toxicity. Blocking the Sxc-/GPx4/ROS signaling pathway can induce ferroptosis and effectively inhibit the proliferation of bladder cancer cells. In our previous study, it was found that sorafenib could suppress the expression of ferroptosis upstream target—cystine/glutamate antiporter (System xc-, Sxc-), but it was unable to block downstream signal transduction, which caused the failure of ferroptosis regulation; while glutathione peroxidase 4 (GPx4) inhibitor FIN56 had no effect on the upstream targets. Based on these results and bioisosterism strategy, in this project two pharmacophores of sorafenib and FIN56—ureido and fluorenonyloximido moieties are organically combined, and a flexible chain with high water solubility is linked at the far end; then three series of fluorenonyloximido bisaryl(thio)urea derivatives are designed and synthesized. Their antiproliferative effects and function in mediating ferroptosis will be evaluated at multiple levels (cellular, molecular, genetic, and animal), the molecular mechanisms of anti-bladder cancer and structure-activity relationships will be elucidated. Finally, 1–2 candidates with high efficacy in inhibiting bladder cancer cell proliferation, low side effects, and suitable for intravesical instillation will be obtained.

膀胱癌治疗中吡柔比星等效果不佳，其它诸多化疗药物或因水溶性过低无法灌注给药，亟待研究开发可高效杀灭癌细胞，毒副作用低，制剂方便的灌注治疗药物。阻断Sxc-/GPx4/ROS信号通路可诱发铁死亡，高效抑制膀胱癌细胞增殖。本课题组前期研究表明索拉非尼可抑制铁死亡上游靶点胱氨酸/谷氨酸反向转运体（Sxc-）的表达，但是下游信号通路规避了其调控，造成铁死亡逃逸；谷胱甘肽过氧化物酶4（GPx4）抑制剂FIN56对上游无调控作用。本项目拟针对Sxc-/GPx4/ROS信号通路，以FIN56和索拉非尼为先导化合物，拼合其分子结构中药效团芴酮肟基和脲基，并在末端连接具有良好水溶性的柔性链，设计合成三个系列芴酮肟基-双芳基（硫）脲衍生物。项目将在细胞、分子、基因和整体动物多个水平考察所合成化合物抗膀胱癌的活性，深入研究其诱导铁死亡和抑制增殖的功能；探讨其作用机制及构效关系。经过活性筛选，以期获得1–2个可高效抑制膀胱癌细胞增殖，毒性低，适宜灌注的候选化合物。

在本课题组已报道的化合物8g基础上，设计、合成得到四个系列喹唑啉基-芳基脲衍生物，以及一个系列吡嗪基-芳基脲衍生物，均为新化合物（合计>100个）。较其他细胞株，膀胱癌细胞株对这些化合物更敏感，共筛选获得5个活性佳的化合物：7j，5-23，8-9, 9g，10b，其中9g和10b对5637细胞株的IC50 < 2 μM。，然后进行分子和基因水平分析和验证，以及小动物体内药物动力学，代谢产物，以及抑瘤活性研究。实验结果：（1）化合物7j与T24细胞共孵育后，可触发三种不同的死亡模式，包括凋亡、铁死亡和自噬。化合物7j，9g和10b通过调控胞内Sxc-/GPx4/ROS信号通路导致细胞铁死亡。（2）化合物5-23通过激活RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路导致细胞发生程序性坏死。（3）三个化合物8-9, 9g和10b还可通过下调胞内HMGCS1、HMGCS2和HMGCR等胆固醇合成相关蛋白（酶）的表达，影响胞内胆固醇的合成，同时抑制侵袭迁移，最终导致细胞死亡。（4）上述三个化合物能够抑制T24荷瘤裸鼠肿瘤的生长，且化合物8-9毒副作用非常低，而9g和10b抑瘤活性明显优于阳性参照药物索拉非尼和厄达替尼。（5）化合物9g和8-9在大鼠体内的代谢产物相似，其中9g的代谢产物超过40种。（6）构效关系研究表明4-氨基喹唑啉基和脲基是关键性的两个药效团；左侧喹唑啉环6-位的烷氧基链影响脂水分配系数，进而影响体内吸收及代谢。另外，我们合成得到3种青蒿琥酯基-二苯基脲衍生物，其中1个化合物ARS-DPU可逆转耐药T24/Reg和T24/Sor的耐药性。本研究的创新性：以3-氨基苄基为中间连接链的喹唑啉基-芳基脲衍生物为本课题组首次构建，可诱导膀胱癌细胞株发生铁死亡为首次报道。已发表密切相关的SCI论文2篇，申请中国发明专利2项，其中1项已授权。后续将对化合物9g进一步结构改造，力争获得1个具有良好应用前景的化合物，并逐步向临床试验推进。