热带雨林土壤微生物抗瓜类枯萎病基因资源的挖掘与利用

构建海南岛热带雨林特色土壤微生物宏基因组Fosmid文库，库容超过30 000个克隆，包含超过1G bp的微生物基因信息；同时，以西瓜枯萎病作为研究对象，采用抑菌圈法和抑制孢子萌发的方法，功能驱动筛选土壤微生物宏基因组Fosmid文库，获得抗瓜类枯萎病的活性产物；并利用气质联用（GC-MS）和四大光谱鉴定该活性产物的结构；构建和筛选亚克隆，并对活性亚克隆进行测序，获得编码活性产物的完整基因（基因簇）；分离西瓜内生菌株，建立该活性产物的异源高效表达体系，开发1-2种抗瓜类枯萎病的药物。

瓜类枯萎病是葫芦科上的一种毁灭性土传病害，普通化学药剂不易防治。而热带雨林微生物丰富，与枯萎病菌具有相近的生态位。同时，由于高温高湿、酸性重等特性，微生物极端而丰富，可开发成生防资源。然多数是非培养的。宏基因组能跨越该瓶颈，直接对微生物基因进行研究，获得功能基因及活性产物。因此，以西瓜枯萎病为研究对象，依托海南热带雨林丰富的微生物资源，利用宏基因组技术挖掘抗枯萎病基因资源及活性产物，为枯萎病的生防提供技术支持。具体如下：.1.真菌多样性分析：分析了雨林土壤真菌物种丰度、优势种群和进化关系等群落结构特征，以期为开发利用这一特殊环境中丰富微生物基因资源提供依据。文库包含21个OTU，以子囊菌和担子菌为主，各占64.7%和15.5%，子囊菌以盘菌为主，占总的47.4%，担子菌中以伞菌为主，占10.4%，接合菌和壶菌较少。.2.宏基因组文库构建和筛选：构建并特征分析热带雨林宏基因组Fosmid文库。库容30624个克隆，平均插入片段36.5kb，包含超1 Gb微生物基因组，无同源序列87.79%，有利于筛选非培养微生物基因资源；功能驱动筛选出抗西瓜枯萎病活克隆4个：129C、142E、142G和153G；盆栽防效分别为63.09%、53.28%、41.65%和34.80%。.3.亚克隆构建、筛选：构建亚克隆表达文库es142E、es142G和es153G，库容均含576个克隆；从es142E中筛选出活性亚克隆unpks-5，与未培养细菌来源的3-oxoacyl-ACP synthase基因氨基酸序列相似性为84.15%。.4. 129C序列分析和活性产物鉴定：序列全长39.145kb，含38个ORF，8个ORF在同一转录单元，可能参与抗枯萎病功能基因表达。包括乙酰辅酶A水解酶、酰基辅酶A脱氢酶、聚酮合成酶、聚酮化合物环化酶、辅酶A转移酶等。pks基因核酸全长1641bp，编码547个氨基酸；经萃取、柱纯化、HPLC和GC-MS将活性物质鉴定为2,4-二乙酰基间苯三酚；. 5.异源表达体系构建：利用内生菌株YA-1，表达pepks、unpks基因，实现抗病菌株介导抗病基因表达外源基因联合高效抗病体系。对枯萎病的抗性分别达71.38%和60.98%。本研究建立的高效表达体系可用于西瓜枯萎病防治。.发表国内核心2篇，会议论文1篇，会议报告1次，待发表核心1篇，待申请专利1项。