低氧预处理SVF源性EPC在组织工程膀胱血管化中的作用及机制

Currently, insufficient blood supply of bladder surrogate area is the main reason that restricts the construction of tissue engineering bladder. Reports found that adipose stromal vascular fraction (SVF) derived endothelial progenitor cell (EPC) could differentiate into mature vascular endothelial cell, which exhibits a good application prospect in the research of tissue engineering. However, to the best of our knowledge, there is no research that reports the application of SVF derived EPC on the construction of tissue engineering bladder. Previously, we have successfully isolate SVF derived EPC, which was found to exhibit enhanced angiogenic paracrine activity and cell survival under hypoxic preconditioning. Therefore, we assume that hypoxic preconditioned SVF derived EPC could play an important role in promoting angiogenesis of tissue engineering bladder. In this study, SVF derived EPC were isolated, hypoxic preconditioned, seeded onto our previous prepared porous porcine bladder acellular matrix (BAM) with well-preserved bioactive factors, and then implanted in vivo to replace partial rat bladder. The effect of hypoxic preconditioned SVF derived EPC on bladder regeneration was investigated by histological and functional studies. The mechanism of hypoxic preconditioned SVF derived EPC promoting angiogenesis of tissue engineered bladder was also discussed with cell tracer and molecular biology techniques. This study will provide a new method for the angiogenesis of tissue engineering bladder.

目前，膀胱替代区血供不足是制约组织工程膀胱构建的重要因素。研究发现，来源于脂肪基质血管成份(SVF)的内皮祖细胞(EPC)可定向分化为成熟血管内皮细胞，在组织工程领域显示了很好的应用前景。但目前尚无在组织工程膀胱构建的相关报道。在前期研究中我们成功分离培养了SVF源性EPC，且预实验发现：低氧预处理可增强上述EPC成血管特征并提高其存活率。在此基础上，我们提出科学假说：低氧预处理SVF源性EPC可在组织工程膀胱血管化过程中发挥重要作用。为此，我们在已成功制备“多孔的保留有生物活性因子的猪膀胱无细胞基质(BAM)”基础上，分离SVF源性EPC，经低氧预处理后接种到BAM，进行大鼠膀胱部分替代，建立组织工程膀胱动物模型。采用组织学、尿流动力学及细胞示踪、分子生物学等技术，从结构和功能两方面观察低氧预处理SVF源性EPC在组织工程膀胱血管化中的作用及其机制。可为组织工程膀胱血管化提供一种新方法。

组织工程技术为膀胱的再生修复提供了新思路。然而，膀胱替代区域血供不足仍是制约组织工程膀胱构建的重要因素。因此，提高膀胱替代区域血管化是成功构建组织工程膀胱的关键环节。研究发现，内皮祖细胞（EPC）可定向分化为成熟血管内皮细胞，在组织的新生血管形成过程中具有重要作用，为一种有前景的血管化种子细胞。但移植物局部缺血、缺氧严重限制了EPC的存活，而低氧预处理可有效增强干细胞治疗效果。课题组前期工作中已掌握了从脂肪组织中分离培养EPC-即脂肪源性EPC（ADEPC）的新方法，采取前期工作中已成功制备的膀胱脱细胞基质（BAM）作为支架材料，进行膀胱替代研究。研究目标为观察低氧预处理ADEPC在组织工程膀胱血管化中的作用，并进一步探讨其作用机制。课题组成功分离培养了ADEPC和大鼠主动脉EC，并进行了相应的细胞鉴定。将SD大鼠随机分为3组，即对照组（BAM组）、ADEPC组和低氧预处理ADEPC（hp-ADEPCs）组。采用BAM或接种ADEPC的BAM进行膀胱部分替代，术后1和3月进行膀胱功能及组织学检测。结果表明，与单纯BAM组及ADEPC/BAM组相比，hp-ADEPCs结合BAM可更好地促进膀胱的血管再生，有利于膀胱平滑肌及神经的再生，进而促进膀胱功能恢复。免疫荧光染色结果表明，ADEPC仍可在体内存活，并直接参与膀胱血管再生。低氧预处理一方面可增强ADEPC的增殖能力、降低ADEPC在低氧环境下的凋亡率；另一方面，将低氧预处理的ADEPC与EC共培养，可显著提高EC的增殖、迁移及成血管能力。此外，低氧预处理可上调ADEPC中细胞外调节蛋白激酶（ERK）/低氧诱导因子1α（HIF-1α）信号通路表达，从而增强血管内皮生长因子A （VEGFA）、碱性成纤维生长因子（bFGF）等促血管生成因子的释放，进而发挥上述作用。本课题研究结果表明，ADEPC作为组织工程膀胱血管化的种子细胞，不仅可分泌促血管生成因子，还可直接参与血管生成，进而促进膀胱血管再生。此外，采用低氧预处理ADEPC的方法，可显著促进膀胱血管再生。可为组织工程膀胱研究提供了血管再生的种子细胞，为组织工程膀胱血管化研究提供了一种新方法。