柑橘溃疡病菌多样性的tale基因调控柑橘感病性的机理研究

Citrus bacterial canker (CBC) caused by Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) is one of the most important bacterial disease in citrus, which occurs severely in citrus main producing region in China. The pathogenic bacteria rely on transcription activator-like effector (TALE) encode by tale genes to activate disease susceptibility of host citrus. We previously found that Chinese Xcc strains exhibit genetic diversity based on tale genes and a potential disease susceptibility gene CsLOB1 is targeted by a major virulence TALE effector PthA. However, the molecular mechanisms of diverse tale genes manipulating citrus susceptibility is unknown. In this proposal, we are going: to isolate the tale genes which are specific in Chinese Xcc strains, then evaluate the role of individual tale gene in pathogenicity by inoculation using a tale-free strain; to identify TALE-targeted S gene in citrus and to reveal the functions of these S genes for citrus canker development by several approaches including RNA-seq technology, TALE-target computational prediction, designing dTALE and ChIP technology. Through the suggested project, we expect to understand the molecular mechanisms how the tale genes manipulate citrus susceptibility and obtain broad spectrum plant resistance to most kinds of citrus canker.

由柑橘溃疡病菌(Xcc)引起的细菌性溃疡病是柑橘上最重要的病害之一，在我国柑橘主产区发生严重。病原菌利用由tale基因编码的转录激活类似效应因子（TALE）来激活柑橘的感病性。我们前期研究发现中国Xcc菌株含有的tale基因呈现遗传多样性以及主效毒性TALE蛋白PthA在柑橘中的靶标基因为感病基因CsLOB1。但是，这些tale基因调控柑橘感病性的机理未知。为了明确这些tale基因在致病性中的作用，本项目拟分离中国Xcc菌株特异的tale基因，通过tale-free菌株介导的接种方法来评价单个tale基因在致病性中的贡献；利用RNA-seq、计算生物学、dTALE和ChIP等途径鉴定TALE蛋白对应的S基因和其在溃疡病斑形成中的功能来揭示tale基因调控柑橘感病性的机理，为培育广谱的抗溃疡病的柑橘材料奠定基础。

柑橘黄单胞菌柑橘致病变种（Xanthomonas citri pv.citri, Xcc）引起的细菌性溃疡病是柑橘上最重要的病害之一，在我国柑橘主产区发生严重。病原菌利用由tale基因编码的转录激活类似效应因子（TALE）来激活柑橘的感病性。我们前期研究发现中国Xcc菌株含有的tale基因呈现遗传多样性以及主效毒性TALE蛋白PthA在柑橘中的靶标基因为感病基因CsLOB1。但是，这些tale基因调控柑橘感病性的机理未知。为了明确这些tale基因在致病性中的作用，本研究分别从中国菌株Xcc003、Xcc015及Xcc086菌株中分离到5个特异的tale基因，其中tal 003-4.4和tal 086-78分别含28个和20个RVD，系统进化树分析属于Clade V。5个tal基因的表达能够增加Xcc049E在葡萄柚叶片中生长适应性。通过RNA-Seq分别筛选出42个和21个上调基因启动子区存在TALE 086-78和TALE 003-4.4结合的EBE区。通过EMSA试验证明TALE蛋白003-4.4和086-78能够与Cs2g22130启动子EBE区序列结合，Cs2g22130属于GRAS转录因子家族，具有转录激活活性，蛋白定位在细胞核和细胞膜。人工设计合成其dTALE-SCL32能够激活Cs2g22130基因表达且接种区域的叶肉组织未被破坏，发病程度轻。EMSA和酵母单杂交试验证明CsLOB1能与Cs2g27820和Cs4g02980启动子互作。Cs2g27820蛋白定位在细胞核和核膜上。人工设计合成其dTALE-XCP1能够激活CsLOB1、CsPR1和Cs2g27820基因表达。使用YAO：SpCas9系统在暗柳甜橙上进行基因编辑，分别设计gRNA: Cs2g22130，gRNA:Cs2g27820和gRNA: Cs4g02980靶点获得基因编辑阳性苗。这些研究表明CsLOB1是控制柑橘感病性的主要途径，其中一些TAL蛋白介导了溃疡症状发展过程中柑橘植物的一些生理变化过程，也更好的理解了TAL效应因子和CsLOB1的功能，为培育广谱的抗溃疡病的柑橘材料奠定基础。