WT1基因组蛋白乙酰化修饰对猪克隆胚胎细胞核重编程的调控机制

细胞核不完全重编程导致动物克隆效率低下、克隆后代发育异常，严重制约动物克隆技术的发展和应用。而组蛋白乙酰化异常是细胞核不完全重编程的重要原因之一。本实验室通过添加丁酸钠（去乙酰酶抑制剂）处理猪克隆胚胎，提高了克隆胚胎组蛋白乙酰化水平，进而提高了猪克隆胚胎的发育率。以此为基础，本项目拟运用细胞核移植技术、染色质免疫沉淀(CHIP)技术、Real-Time PCR和Western Blot等分子生物学技术，深入研究猪克隆胚胎不同发育阶段WT1基因启动子区域的H3和H4组蛋白特定位点的乙酰化状态，WT1基因在克隆胚胎不同发育时期的mRNA和蛋白水平表达的差异，旨在发现WT1基因组蛋白乙酰化修饰对猪克隆胚胎细胞核重编程的调控机制，揭示WT1基因的异常表达与克隆胚胎发育异常的相关性。为丰富表观遗传学的相关理论，使动物克隆技术早日应用于家猪育种、人类疾病模型和人类异种器官移植等生产实践提供理论依据。

细胞核不完全重编程导致动物克隆效率低下、克隆后代发育异常，严重制约动物克隆技术的发展和应用，而组蛋白乙酰化异常是细胞核不完全重编程的重要原因之一；同时，威廉姆氏瘤基因1（Wilms’ tumor gene 1,WT1）表达异常能导致巨大胎儿等诸多与克隆动物表型异常相似的症状。因此，研究WT1基因组蛋白乙酰化对克隆胚胎细胞核重编程的作用，明确克隆胚胎WT1基因组蛋白乙酰化在克隆胚胎发育中的调控机制具有重要的科学意义与实用价值。本项目运用细胞核移植技术、细胞免疫荧光化学染色技术、RT-PCR及荧光定量PCR技术等分子生物学技术，深入研究了植入前猪克隆胚胎不同发育阶段WT1的mRNA和蛋白水平表达的差异，以及WT1基因下调对胚胎发育的影响；同时，通过组蛋白去乙酰基酶抑制剂丁酸钠的应用，研究了组蛋白乙酰化修饰的改变对猪卵母细胞体外成熟、纺缍体形成和胚胎组蛋白乙酰化表达模式及发育相关基因表达的影响。研究发现，WT1在猪卵母细胞及不同发育时期的植入前胚胎中均有表达；pLV3-WT1 shRNA慢病毒载体可以高效转染植入前胚胎，使WT1表达量下降，并导致大多数植入前胚胎发育停滞在8-细胞及桑椹胚时期，仅有一小部分发育到囊胚时期，同时囊胚中的大量细胞发生凋亡。另外，在减数分裂恢复初始阶段应用去乙酰基酶抑制剂丁酸钠抑制卵母细胞组蛋白的去乙酰化，会显著抑制卵母细胞的核成熟，抑制强度随作用时间延长而增强；在生发泡破裂后短时间抑制组蛋白去乙酰化可以增强卵母细胞的核成熟，但对其后续发育无明显作用；用组蛋白去乙酰基酶抑制剂丁酸钠处理体细胞克隆胚胎12h，可以明显增强原核期胚胎的组蛋白H3K14的乙酰化水平，并且可以改变胚胎后续发育中组蛋白H3K14乙酰化表达模式及相关基因的表达，从而促进胚胎发育。研究结果表明，WT1对植入前胚胎的发育有着十分重要的作用，组蛋白乙酰化修饰在卵母细胞成熟及早期胚胎发育过程中发挥重要作用。本项目揭示了WT1基因的异常表达与克隆胚胎发育异常的相关性，同时为进一步研究胚胎发育中表观遗传调控机制及胚胎发育机理提供了重要的理论和实验依据。